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.2012年11月；56(5):1958-70.
doi:10.1002/hep.25757。 Epub 2012年10月14日。

基本的螺旋-环-螺旋转录因子，心脏和神经嵴衍生物表达转录物2，标记斑马鱼的肝星状细胞：星状细胞进入发育中的肝脏的分析

尹春月 1, 金伯利·J·埃瓦森, 杰奎琳·马赫, 迪迪埃·Y·R·斯坦尼尔
附属公司

基本螺旋-环-螺旋转录因子、心脏和神经嵴衍生物表达转录物2，标记斑马鱼肝星状细胞：星状细胞进入发育中肝脏的分析

尹春月等。 肝病学. 2012年11月.

摘要

肝星状细胞（HSC）是肝脏特异性间充质细胞，在肝脏发育和损伤中起着重要作用。由于缺乏体内数据，我们对HSC生物学的了解有限。HSC和窦状内皮细胞（SEC）非常接近，这两种细胞类型之间的相互作用对其发育和功能至关重要。在这里，我们介绍了标记HSC的转基因斑马鱼系Tg（hand2:EGFP）。我们发现斑马鱼HSC与哺乳动物HSC有许多相似之处，包括形态、位置、脂质储存、基因表达谱、增殖和基质生成增加，以应对急性肝损伤。使用Tg（hand2:EGFP）线，我们在发育过程中进行了时间进程分析，以揭示HSC在SECs之后侵入肝脏。然而，HSC仍以缺乏大多数内皮细胞（包括SECs）的突变形式进入肝脏，这表明HSC分化或进入肝脏不需要SECs。在缺乏SEC的情况下，HSC与肝胆管细胞异常相关，这表明SEC影响肝发育过程中HSC的定位。我们分析了调节HSC发育的因素，并表明抑制血管内皮生长因子信号传导可显著减少进入肝脏的HSC数量。我们还进行了初步的化学筛选，并确定了两种在开发过程中影响HSC数的化合物。

结论：我们的工作首次全面描述了斑马鱼HSC的发展，并揭示了SEC在HSC本地化方面的要求。Tg（hand2:EGFP）系是体内分析和HSC行为分子解剖的独特工具。

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数字

图1
图1
Tg（手柄2：EGFP）在斑马鱼肝脏内的新细胞群中表达。（A） 整体安装就地杂交显示内源性表达手动2受精后4天野生型幼虫。手动2表达于咽弓（Ph）、鳍芽（fin）、肝脏（Li）和肠周围的间质（Int）。（A'）Tg（手柄2：EGFP）表达类似于手动2.（B）4 dpf时，Tg（手柄2：EGFP）表达于肝脏内壁的单细胞层（箭头）以及肝脏内的星形细胞（星号）。（C-E）表达Tg（手柄2：EGFP）与肝细胞标记物的表达不重叠Tg（制造10a：dsRed）（C）、胆道细胞标记物Alcam（D）或内皮细胞标记物Tg（kdrl：ras-mCherry）（E）。尤其是，Tg（手柄2：表达EGFP的细胞似乎包裹在内皮细胞周围（E，箭头）。（F）Tg（手柄2：EGFP）在成年斑马鱼肝脏振动切片中的表达。与在幼虫肝脏中观察到的情况类似，Tg（手柄2：成人肝脏中EGFP）表达细胞与内皮细胞非常接近。（A，A'）整个斑马鱼幼体，背部视图，顶部前方。（B-F）斑马鱼肝脏的共焦单平面图像。（B-E）背视图，位于顶部前方。A、 前部；P、 后部；五十、 左；R、 对。比例尺：（A，A'）100μm；（B-F）20μm。
图2
图2
Tg（手柄2：EGFP）的表达标志着斑马鱼肝脏中的HSC。（A-B）Tg（手柄2：EGFP）在肝脏中的表达。（A’-B’）与（A-B）视图相同，但显示GFAP和结蛋白的免疫染色。Tg（手柄2：EGFP）的表达在这个阶段与GFAP和结蛋白抗体标记有很大重叠（箭头）。（C） 成年斑马鱼肝脏的振动切片显示，氯化金染色显示存在维生素A。（D）Tg（手柄2：表达EGFP的细胞在成人肝脏的振动切片上沉积油红O染色所示的脂滴。（A-B，A'-B'，D）斑马鱼肝脏的共焦单平面图像。（A-B，A'-B'）背视图，位于顶部前方。比例尺，20μm。
图3
图3
急性乙醇处理导致细胞外基质蛋白沉积增加和HSC数量增加。（A，B）未经处理的对照组（A）和用2%乙醇处理的幼虫（96至120 hpf）HSC的共焦单平面图像（B）。治疗后立即收集动物并进行检查。（A'，B'）与（A，B）的视图相同，但显示层粘连蛋白沉积。乙醇处理动物中的HSC上调了层粘连蛋白的生成，并表现出形态变化。对来自六个离合器的30只对照动物和30只经乙醇处理的动物进行了检查，所有动物的层粘连蛋白沉积均增加。（C，D）共聚焦投影显示未经治疗的对照组和经乙醇处理的幼虫在治疗后三天（dpt）出现HSC。乙醇处理的幼虫中的HSC数量较多，细胞体更长，细胞质过程较不复杂。（E） 治疗后（0 dpt）以及治疗后1、2和3天，对照组和乙醇处理组动物的HSC数量（平均值±SEM）。在每个时间点，检查来自两个离合器的10个对照和10个乙醇处理的幼虫。对照组和治疗组动物在第1天、第2天和第3天的HSC细胞数差异具有统计学意义（p<0.05）。（F） 乙醇处理期间或处理后一天纳入EdU的HSC百分比（平均值±SEM）。在这两个时间点，对10只对照和10只经乙醇处理的幼虫进行了检查。星号表示统计显著性：*p<0.05。（A-D）背视图，位于顶部前方。比例尺，20μm。
图4
图4
斑马鱼HSC的发展。（A-F）HSC和SEC的时间进程分析Tg（hand2:EGFP；kdrl:ras-mCherry）幼虫。在62至76 hpf之间，每隔2小时固定8只幼虫，并对其进行GFP（绿色）和dsRed（红色）染色。（A-B）中的箭头和星号分别表示SEC和HSC的位置。（C-D）中的箭头指向未伴随HSC进入肝脏的SEC。（D）中的箭头指向与SEC相关的进入肝脏的HSC。（A-F）横向振动节的共焦投影，背向顶部。肝内（G-H）HSC增殖率低。五Tg（手柄2:EGFP）幼虫在65至81 hpf之间每隔2小时固定一次，并染色以标记增殖细胞的磷组蛋白3（蓝色）。100Tg（手柄2：EGFP）表达细胞被发现为磷酸组蛋白3阳性，但其中只有8个位于肝脏内部（G箭头）。剩余的细胞位于肝脏外围（H-J中的箭头所示）。在这些细胞中，39个位于肠道附近（H箭头），25个位于肠道后部（I箭头），11个位于肠道远端（J箭头）。（G-J）顶部前方的肝脏共焦单平面图像。虚线勾勒出肝脏轮廓。比例尺，20μm。D、 背侧；五、 腹部。
图5
图5
clo（克隆）变异的肝脏仍然含有Tg（手柄2：EGFP）表达细胞。（A-B）野生型和clo（克隆）突变幼虫是从clo（克隆）杂合子鱼也是纯合子手柄2:EGFP和kdrl:ras-mCherry公司转基因。4 dpf时，野生型肝脏形成了清晰的血管网Tg（kdrl：ras-mCherry）表达（A），内皮细胞在clo（克隆）突变肝脏（B）。（A’-B’）共焦重建肝脏横截面，如（A-B）所示。白色虚线（A-B'）勾勒出肝脏的轮廓。（A-B）中的黄色虚线表示重建截面的标高。（C-D）表达Alcam（红色）和表达HSC的肝胆细胞的分布Tg（手柄2：EGFP）（绿色）。在野生型（C）中，大多数HSC（星号）由肝细胞（括号表示）与胆汁细胞（箭头）分离。相反，在clo（克隆）突变肝脏（D）、HSC与胆道细胞密切相关（箭头所示）。（E） 野生型和clo（克隆）突变幼虫。通过Prox1染色检测肝细胞（25）。4个野生型和4个clo（克隆）突变幼虫在4dpf下进行分析。星号表示统计显著性：*p<0.05***p<0.001。（A-B，C-D）共焦单平面图像，位于顶部前方。比例尺，20μm。
图6
图6
在发育过程中抑制VEGF信号传导降低HSC数量。（A-C）抑制VEGF信号以剂量和时间依赖性的方式减少肝内血管分支和HSC的数量。（A） 肝脏的共焦投影Tg（hand2:EGFP；kdrl:ras-mCherry）用DMSO或VEGF受体抑制剂SU6415处理55至80 hpf或72至96 hpf的幼虫。背视图，位于顶部前方。（B） 用二甲基亚砜、1μM SU6415或2μM SU64 15处理的动物肝内血管分支的数量（平均值±SEM）。（C） 同一动物中HSC的数量（平均值±SEM）。（D） Kdrl水平的降低导致HSC数量减少。左侧面板显示未注射对照组和kdrl（kdrl）吗啉（MO）-在80 hpf时注射幼虫。右图显示了未注射对照中HSC的数量（平均值±SEM），以及kdrl（kdrl）-击倒动物。（E） HSC数量（平均值±SEM）clo（克隆）用二甲基亚砜或SU5416处理的突变体。VEGF信号传导抑制降低了HSC的数量clo（克隆）突变体。（A，D）白色虚线勾勒出肝脏的轮廓。比例尺，20μm。（B-E）分析的动物数量显示在图表底部。星号表示统计显著性：*p<0.05**p＜0.01***p<0.001****p<0.0001。
图7
图7
化学筛选可识别改变HSC编号的化合物。（A） 化学屏幕设置，用卡通说明感兴趣的表型，例如与对照组（左侧动物）相比HSC数量减少（中间动物）和HSC数量增加（右侧动物）。（B） 用二甲基亚砜、AM580或甲氧脯酸（MA）处理的动物中HSC的数量（平均值±SEM）。分析的动物数量显示在图表的底部。星号表示统计显著性：*p<0.05**p<0.01。（C） 肝脏的共焦投影Tg（手柄2:EGFP）用DMSO、AM580或MA处理55至80 hpf的幼虫。背视图，位于顶部前方。白色虚线勾勒出肝脏的轮廓。比例尺，20μm。
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