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.2012年9月；56(3):1129-39.
doi:10.1002/hep.25754。

组蛋白甲基转移酶ASH1在肌成纤维细胞转分化过程中调控成纤维基因转录

玛丽亚·杰西斯·佩鲁戈里亚 1, 卡罗琳·威尔逊, Mujdat Zeybel公司, 梅根沃尔什, 石路阿敏, 斯图尔特·罗宾逊, 史蒂文·怀特, 阿拉斯泰尔·德·伯特, 菲奥娜·奥克利, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, 德里克·阿曼, 杰勒娜·曼
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组蛋白甲基转移酶ASH1在肌成纤维细胞转分化过程中调控成纤维基因转录

玛丽亚·杰西斯·佩鲁戈里亚等。 肝病学. 2012年9月.
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摘要

肝星状细胞向肌成纤维细胞样表型的转化分化是肝纤维化的关键事件。基因表达的全球变化支持了与转分化相关的表型的巨大变化。基因表达的协同变化发生在染色质包装的水平上，染色质包装由表观遗传调节因子的酶活性调节，而表观遗传调控因子反过来影响组蛋白修饰。通过对静止和激活的原代HSC中表观遗传调节因子的表达谱分析，我们发现许多组蛋白甲基转移酶，包括MLL1、MLL5、Set1和ASH1，在HSC转分化过程中高度上调。所有这些组蛋白甲基转移酶都调节组蛋白H3的赖氨酸4的甲基化，这是活性转录基因的特征。因此，我们推测这些酶中的一种或多种可能参与积极影响促纤维化基因的表达。

结论：我们发现ASH1直接与活化的HSC中α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）、I型胶原、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP1）和转化生长因子β1（TGFβ1）的调节区结合，而ASH1的缺失导致纤维生成基因表达的广泛抑制。我们还发现，MeCP2正向调节ASH1的表达，因此确定ASH1是MeCP2表观遗传中继途径的关键转录激活因子，该途径协调多个纤维化前基因的诱导。

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数字

图1
图1
静止和激活HSC中表观遗传调控因子的表达谱。（A） 用SDS-PAGE分离三种不同的原代大鼠qHSC（培养第1天）或活化HSC（培育第10天）制剂中的10μg全细胞蛋白提取物，并对αSMA、H3K4me2、H3K4me3、H3K 9me3、H3 K36me3、H 3K27me2和H 3K27 me3组蛋白修饰进行免疫印迹。使用总组蛋白H3和β-肌动蛋白对照评估等量负荷。通过qRT-PCR对三种不同的原代大鼠qHSC（第0天）和第10天转分化肌成纤维细胞制剂中组蛋白赖氨酸甲基转移酶和去甲基化酶的（B-E）信使RNA（mRNA）水平进行定量。所列酶的别名如下：SUV39H1（KMT1A）、SUV39H2（KMT1B）、G9a（KMT1C）、GLP（KMT1D）、SETDB1（KMT1E）、MLL1（KMT2A）、MLL2（KMT_2B）、MLL3（KMT2C）、MLL-5（KMT2E）、SET1a（KMT2F）、NSD1（KMT3B）、ASH1（KMT2H）、SMYD2（KMT.3C）、DOT1（KMT-4）、EZH2（KMT6）、SUV-4H1（HMT5B）、SUV4-20H2（KMT5C）、LSD1（KDM1）、JMJD2A（KDM4A）、JMJP2B（KDM4]），JMJD2C（KDM4C），JMJD2D（KDM4D），JARID1B（KDM5B），JMJD3（KDM6B）。误差条表示平均值±平均标准误差（SEM）*P（P）< 0.05.
图2
图2
在HSC的MTD期间，ASH1、Set1和MLL5组蛋白甲基转移酶的表达高度上调。使用从CCl分离的HSC提取的RNA对ASH1、Set1和MLL5 mRNA进行（A-C）qRT-PCR分析4（或橄榄油）和BDL（或假手术）损伤大鼠肝脏（n=5）或原代人qHSC或活化HSC。误差线代表平均值±SEM*P（P）< 0.05. （D） 用SDS-PAGE分离大鼠和（E）原代人qHSC或活化肌成纤维细胞的三种不同制剂中的30μg全细胞蛋白提取物，并对Set1、ASH1、MLL5和β-肌动蛋白进行免疫印迹。
图3
图3
ASH1，而不是MLL5或Set1，与促纤维化基因的调控区结合。将100μg来自原代大鼠肌成纤维细胞的交联染色质与10μg（A）抗MLL5、（B）抗Set1、（C）抗ASH1或（D）抗MLL1抗体孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA被用作qPCR反应的模板，使用TIMP-1、αSMA、TGF-β-1和胶原I远端启动子区域特异性引物（n=3）*P（P）<0.05和**P（P）< 0.01.
图4
图4
ASH1积极影响TIMP-1、TGF-β-1和胶原蛋白I的表达在体外通过SDS-PAGE分离培养物，并对ASH1、胶原蛋白I、αSMA、TIMP-1和β-肌动蛋白进行免疫印迹。（B） 将来自原代大鼠静止HSC（顶面板）或肌成纤维细胞（底面板）的100μg交联染色质与10μg抗三甲基H3K4孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA被用作qPCR反应的模板，使用TIMP-1、αSMA、TGF-β-1和胶原I远端启动子区域特异性引物（n=3）。（C） 5×106用2μg对照或ASH1 siRNA电穿孔大鼠肌成纤维细胞。48小时后采集细胞，分离RNA和蛋白质。进行ASH1表达的qRT-PCR分析（上图）。用SDS-PAGE分离20μg全细胞蛋白提取物，并对ASH1和β-肌动蛋白进行免疫印迹（底图）（显示代表性凝胶，n=3）。（D） 从转染对照或ASH1 siRNA的肌成纤维细胞中分离的RNA用于TIMP-1、αSMA、TGF-β-1和胶原蛋白I（n=3）的qRT-PCR分析。误差线代表平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图5
图5
（A） MeCP2和ASH1在顺序调控途径中运行，最终导致促纤维化基因的转录激活。（B） 用SDS-PAGE从三种不同的C57Bl6原代小鼠肌成纤维细胞制剂中分离出20μg全细胞蛋白提取物，并对ASH1和β-肌动蛋白进行免疫印迹。（C） qHSC从WT或机械2−/年KO肝脏与转分化在体外持续14天。从两个细胞群体中制备总RNA，并进行qRT-PCR分析ASH1和TGF-β-1的表达（n=4）。（D） 从慢性CCl中分离出RNA4-受伤的WT或机械2−/年肝脏，用小鼠ASH1和TGF-β1特异性引物进行qRT-PCR反应（n=4）。误差线代表平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图6
图6
ASH1在大鼠和人类肝病中均高表达。（A） 在BDL大鼠肝脏（BDL）和4周CCl中显示ASH1免疫组化染色的代表性肝脏切片4-损伤大鼠肝脏和正常对照肝脏。（B） 显微照片显示NASH、ALD和PBC患者或ASH1特异性抗体染色的正常肝脏的肝切片。黑色箭头表示ASH1阳性的肝肌成纤维细胞，黄色箭头表示阳性的内皮细胞，红色箭头表示增殖的导管细胞中ASH1的表达。所有显微照片的放大倍数均为400倍。
图7
图7
MTD相关的表观遗传调控途径：MeCP2正向调节EZH2和ASH1组蛋白甲基转移酶的表达。这些HMTase分别调节H3K27和H3K4的甲基化。因此，EZH2是抑制性的，而ASH1激活基因表达。MeCP2蛋白在MTD发病时表达；然后它可能与一个或多个miRNA启动子结合，导致其转录抑制。这些miRNAs的减少可能会释放EZH2和ASH1上的翻译阻滞，进而导致PPAR-γ的抑制（通过EZH2和MeCP2）和I型胶原、TIMP-1和TGF-β1的同时激活（通过ASH1）。或者，MeCP2可以直接激活EZH2和ASH1的表达。
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