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.2012年9月；19(9):1561-70.
doi:10.1038/cdd.2012.34。 Epub 2012年3月30日。

凋亡诱导的线粒体功能障碍导致细胞质脂质滴形成

J博伦 1, K M Brindle公司
附属公司

凋亡诱导的线粒体功能障碍导致细胞质脂质滴形成

J博伦等。 细胞死亡不同. 2012年9月.

摘要

细胞凋亡的一个特征是细胞质脂质滴的快速堆积，这些脂质滴主要由中性脂质组成。来自这些脂质的质子信号已用于使用磁共振波谱的无创检测细胞死亡。我们在这里表明，尽管凋亡诱导脂肪生成相关酶的水平和活性降低（发生在p53激活和mTOR信号通路抑制的下游），但脂质积累的增加是由于从头开始的脂质合成增加。这是由于线粒体脂肪酸β-氧化受到抑制，再加上酰基辅酶A合成酶活性增加，脂肪酸从氧化转移到脂质合成。线粒体膜电位迅速升高和伴随的活性氧水平升高可以解释脂肪酸氧化的抑制。

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图1
图1
细胞凋亡影响控制脂质合成和能量代谢的细胞信号通路。涉及的酶从头开始描述了脂质合成以及调节它们的信号通路。脂质是由柠檬酸盐合成的，柠檬酸盐通过乙酰辅酶A与草酰乙酸的缩合在线粒体中合成后被转运到胞浆中。葡萄糖是柠檬酸碳的主要来源，尽管其他代谢物也可以用作碳供体。脂质合成还需要NADPH，NADPH来源于磷酸戊糖途径和苹果酸酶催化的反应。线粒体和细胞膜的图片来自Servier Medical Art(网址：www.servier.com). ACC1，乙酰辅酶A羧化酶；ACLY，ATP-柠檬酸裂解酶；ACS，酰基辅酶A合成酶；AMPK，AMP-活化激酶；ATM，共济失调-扩张症突变；CPT-1，肉碱棕榈酰转移酶1；DAG，二酰基甘油酯；二酰甘油酰基转移酶；磷酸二羟基丙酮；脂肪酸合成酶；脂肪酸转运蛋白；游离脂肪酸；G3P，3-磷酸甘油醛；G6P，6-磷酸葡萄糖；谷氨酸、葡萄糖转运蛋白；HK，己糖激酶；乳酸脱氢酶；丙酮酸脱氢酶；PK，丙酮酸激酶；固醇受体元件结合蛋白SREBP-1；TAG，三酰甘油酯；TIGAR、Tp53诱导的糖酵解和凋亡调节因子；TSC2，结节性硬化综合征2
图2
图2
细胞凋亡诱导增加了EL4细胞中的脂滴含量和线粒体膜电位。(一)使用ImageStream成像流式细胞仪获得的代表性图像。用15μM etoposide作用2、8或16小时，然后用Bodypy 496/503（染色中性脂质）、MTO（染色线粒体以膜电位依赖方式）、7AAD（DNA染色显示晚期凋亡或坏死）和AV-AF647（早期凋亡指示物）染色。(b条)存活、早期凋亡和晚期凋亡/坏死细胞的分数。根据AV/7AAD染色对细胞群进行门控。结果表示为平均值±S。E.M.并指出至少四个不同实验的平均值，每个样本分析10000个细胞。(c（c）)在诱导细胞死亡后，根据材料和方法中的描述对脂滴数进行量化，并将MTO强度作为线粒体膜电位的测量值（以任意单位表示）。结果表示为平均值±S。E.M.中。，n个=4.*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<0.001
图3
图3
足叶乙甙诱导的细胞凋亡促进脂肪生成。(一)细胞与14在足叶乙甙处理后的指定时间收获前，C-醋酸盐作用1小时。在薄层色谱（TLC）板上分离脂类之前，提取脂类，并根据细胞数量对提取物体积进行标准化。具有代表性的自动射线照片14显示了不同中性脂类中的C-醋酸盐掺入。(b条)TLC板上极性脂质部分的代表性放射自显影14C-醋酸盐掺入。(c（c）)14通过放射自显影的密度分析测定醋酸C-掺入TAG。这些值表示相对于对照组的合并百分比（平均值±S.D。，n个=9). (d日)代表性放射自显影14C-棕榈酸酯并入TLC板上的中性脂质部分。细胞与14C-棕榈酸酯在足叶乙甙处理后的指定时间采集前1小时。将脂质提取缓冲液的体积标准化为细胞数。(电子)培养细胞TLC板上极性脂质部分的代表性放射自显影14C-棕榈酸酯。(（f）)14通过密度计测定C-棕榈酸酯并入TAG。这些值表示相对于对照组的合并百分比（平均值±S.D。，n个=9). (克)用台盼蓝染料排斥试验测定足叶乙甙处理后的细胞存活率。结果表示为平均值±S。D(n个=9). (小时)典型的western blot显示足叶乙甙处理对caspase 3裂解的影响(n个=3).*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<0.001. CE，胆固醇酯；胆固醇；DAG，二酰基甘油酯；Etop，依托泊苷；游离脂肪酸；N、 中性脂质；P、 极性脂质；磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PS，磷脂酰丝氨酸；标签，三酰甘油酯
图4
图4
细胞凋亡调节改变基因表达、蛋白质水平和脂肪酶磷酸化状态的信号通路。EL4细胞用15μM etoposide持续16小时，每2小时获取一次蛋白质样品(一)典型的western blot显示凋亡诱导对p53、Akt、p-Akt（Ser473）、pS6K（Ser371）、pS6K（Thr389）、AMPK和p-AMPK（Thr172）水平的影响。肌动蛋白被用作蛋白质负荷的内部控制。(b条)的表达式级别塞斯特林2(公式图像)和第21页(公式图像)通过定量聚合酶链反应（PCR）获得。结果与它们的初始水平（未经处理的对照）有关。肌动蛋白表达水平用于使结果正常化（平均值±S.E.M。；*P（P）<0.01,**P（P）<0.001,n个=3). (c（c）)的表达式级别ACLY公司(公式图像),ACC1公司(公式图像)和FASN公司(公式图像)通过定量PCR获得。将结果归一化为每个样品中的肌动蛋白水平，并与未经处理的对照组进行比较（平均值±S.E.M。；*P（P）<0.01,**P（P）<0.001,n个=3). (d）免疫印迹分析ACLY、p-ACLY（Ser454）、ACC1、p-ACC1（Ser79）、FASN和ACS水平。肌动蛋白被用作内部蛋白质负荷控制。每个蛋白质都有一个代表性样品
图5
图5
细胞凋亡降低线粒体脂肪酸β-氧化。(一)EL4细胞用15μ在收获前1小时内服用足叶乙甙，1μCi/ml[1-14C] 棕榈酸酯，0.5μCi/ml[1-14C] 油酸盐或2μCi/ml（每毫升）天-[单位-14C] 将葡萄糖添加到培养基中。被困人数14一氧化碳2将其归一化为总细胞数，并表示为未处理对照细胞的百分比（平均值±S.E.M。，n个=9). (b条)用15种不同的组合处理2 h的细胞，测定油酸盐氧化μ依托泊苷（Etop），100μ依托莫西尔（Etom）和/或10μM抗霉素（Ant）。依托莫西和抗霉素治疗均不影响细胞存活率（平均值±S.E.M。，n个=6). (c（c）)油酸盐在处理后并入TAG(b条)，通过薄层色谱（TLC）板自射线照片的密度分析进行评估（平均值±S.E.M。，n个=6).*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<0.001
图6
图6
细胞凋亡诱导增加了细胞内活性氧的水平。(一)用羧基-H染色细胞后，用流式细胞仪测定活性氧水平2与未经治疗的对照组相比，DCFDA和表示为荧光中值增加的百分比（平均值±标准误差。；P（P）所有点均<0.005，n个=6). (b条)用9.5预处理细胞1小时μg/ml生育酚（Toc），然后将足叶乙甙（Etop）添加到细胞培养基中2 h，然后收获细胞。结果表示为对照细胞中数值的百分比（平均值±S.E.M。，n个=3). (c（c）)14在收获前1小时将C-油酸盐添加到细胞中以评估β-氧化。结果相对于对照细胞中的氧化水平表示为平均值±S。E.M.公司。，n个=6. (d日)脂质部分是从处理为(c（c）)如材料和方法中所述，使用薄层色谱（TLC）板的自动射线照相的密度分析来评估油酸盐并入TAG。在(c（c）)和(d日), 1 μM线粒体Q，1μM DecylTPP（12月）或9.5μ在添加15之前1小时向细胞中添加g/ml生育酚μ然后将M etoposide和细胞再培养2 h。12月用于控制三苯基鏻离子对线粒体功能的影响。结果表示为相对于未经处理的对照组的掺入百分比（平均值±S.E.M。，n个=6). 与控制显著不同：*P（P）<0.05,**P（P）<0.01,***P（P）<0.001
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