The UBAP1 subunit of ESCRT-I interacts with ubiquitin via a SOUBA domain

doi:10.1016/j.str.2011.12.013

.2012年3月7日；20(3):414-28.

doi:10.1016/j.str.2011.12.013。

ESCRT-I的UBAP1亚基通过SOUBA结构域与泛素相互作用

莫妮卡·农场主¹, 尼古拉斯·索勒, 安娜·卡巴莱, 托尼亚·库克, 斯特凡·M·弗伦德, 马克·D·艾伦, 马克·拜克罗夫特, 奥尔加·佩里西奇, 于晔, 贝珊·麦克唐纳, 哈特穆特·谢尔, 凯·霍夫曼, 斯图亚特·J·D·尼尔, 胡安·马丁·塞拉诺, 罗杰·威廉姆斯

附属公司

PMID： 22405001
预防性维修识别码：项目经理3314968
内政部： 2016年10月10日/j.str.2011.12.013

ESCRT-I的UBAP1亚单位通过SOUBA结构域与泛素相互作用

莫妮卡·农场主等。结构. 2012.

.2012年3月7日；20(3):414-28.

doi:10.1016/j.str.2011.12.013。

作者

莫妮卡·农场主¹, 尼古拉斯·索勒, 安娜·卡巴莱, 托尼亚·库克, 斯特凡·M·弗伦德, 马克·D·艾伦, 马克·拜克罗夫特, 奥尔加·佩里西奇, 于晔, 贝珊·麦克唐纳, 哈特穆特·谢尔, 凯·霍夫曼, 斯图亚特·J·D·尼尔, 胡安·马丁·西洛, 罗杰·威廉姆斯

附属

¹英国伦敦SE1 9RT国王学院伦敦医学院传染病系。

PMID： 22405001
预防性维修识别码：项目经理3314968
内政部： 2016年10月10日/j.str.2011.12.013

摘要

运输所需的内体分选复合体（ESCRT）有助于泛素化货物的内体分拣、MVB生物发生、胞质分裂晚期和逆转录病毒出芽。这里我们显示，泛素相关蛋白1（UBAP1）是人类ESCRT-I的一个亚单位，与Vps23/TSG101、VPS28和VPS37在稳定的1:1:1:1复合物中结合。UBAP1 C端区域的X射线晶体结构揭示了一个我们描述为重叠UBA螺线管（SOUBA）的畴。核磁共振分析表明，构成SOUBA的三个刚性排列的重叠UBA分别与泛素相互作用。我们证明，含有UBAP1的ESCRT-I对于通过病毒对抗手段，即HIV-1辅助蛋白Vpu和卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）泛素连接酶K5，降解抗病毒细胞表面蛋白，如栓蛋白（BST-2/CD317）至关重要。

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数字

图1
UBAP1与ESCRT-I亚基TSG101、VPS28和VPS37在体外和体内形成稳定的异四聚物复合物（a）ESCRT-I-异四聚体的示意图，说明了推测的UBAP1相对于其他ESCRT-I.亚基的排列。顶部序列比对显示了UMA域，也存在于MVB12A和MVB12B的C端部分。底部显示了不同物种UBAP1 C末端区域中对应于SOUBA结构域的保守序列的详细视图。与三个连续UBA结构域的保守（M/L）-G-（Y/F）基序同源的Hallmark UBA残基分别由蓝色、粉红色和橙色三角形识别。从结构映射的七条α螺旋的位置显示在路线上方。（B）在HiLoad 16/60 Superdex 200柱上对含有UBAP1-His6的重组ESCRT-I进行凝胶过滤。插图显示了含有四聚体ESCRT-I复合物（包括UBAP1）的峰值部分的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶。另请参见表S1和图S1。（C）在Strep-Tactin基质上亲和纯化稳定表达One-Strep标记TSG101（OSHA-TSG101）的细胞的ESCRT-I蛋白复合物，并通过western blot进行可视化。用抗TSG101、抗VPS37A和抗UBAP1抗体通过蛋白质印迹分析1%的起始细胞裂解物和10%的从基质洗脱的体积（下拉）。为了控制结合的特异性，还显示了从稳定表达空载体（OSHA）的细胞中进行纯化。（D）删除分析以确定UBAP1上的最小ESCRT-I结合区域。在C末端带有His6标签的重组UBAP1全长（第4道）或N末端片段（1–92，第3道；1–77，第2道；或1–68，第1道）与TSG101/VPS28/VPS37A ESCRT-I成分共表达于*大肠杆菌*通过亲和层析和凝胶过滤纯化。显示纯化复合物的考马斯染色SDS-PAGE。（E）共沉淀法研究UBAP1与ESCRT-I的相互作用。用表达GST-TSG101、Myc-VPS28、HA-VPS37A/B和HA-UBAP1野生型（WT）或突变型（M1至M4）的质粒转染293T细胞，然后用谷胱甘肽包被的小球纯化。用抗HA抗体进行western blot分析1%的起始细胞裂解液和10%的珠洗脱体积（下拉）。参见图S1和表S1。

图2
UBAP1对病毒对策引发的破伤风蛋白降解至关重要（A）破伤风是从稳定表达栓蛋白的293T细胞免疫沉淀而来。这些细胞未感染（unif），感染了HIV-1（HIV-1 wt）或Vpu缺陷型HIV-1或与针对UBAP1的siRNA（UBAP1Q3和UBAP1Q4）结合。Western blot显示免疫沉淀栓系蛋白（上部）、siRNA-介导的内源性UBAP1沉默（中部）和HSP90作为蛋白质负载控制（下部）。（B）从感染HIV-1（HIV-1 wt）的细胞中免疫沉淀Tetherin，并转染表达HA标记泛素和对照（cont）或UBAP1特异性siRNA（UBAP1 Q3）的质粒。用抗HA抗体（顶面板，THN-Ubn）观察Tetherin泛素化。作为对照，同样的分析是在感染了Vpu缺陷型HIV-1（HIV-1 delVpu）并用无关siRNA（Cont）处理的细胞中进行的。底部面板显示免疫沉淀栓蛋白、UBAP1耗竭和微管蛋白作为负荷控制。（C）感染性HIV-1病毒产生量通过接种TZM-bl指示细胞进行测量，并表示为相对发光单位（R.L.U.）。误差线表示与三个独立实验平均值的标准偏差。另见表S2。

图3
UBAP1耗竭阻止K5介导的Tetherin降解（A）HT1080细胞裂解物的Western blots，该细胞裂解物稳定地单独表达HA-Tetherin（HT1080:HA-THN）或与K5（HT1080：HA-THN/K5）结合，并针对无关对照（cont）、TSG101或UBAP1用siRNA处理。用抗HA抗体检测THN-HA，以微管蛋白作为负荷对照，并用Li-Cor荧光偶联650 nm和800 nm二级抗体进行可视化。图表显示了成熟栓系蛋白水平的百分比，归一化为微管蛋白负荷。误差线表示与三个独立实验平均值的标准偏差。下图显示TSG101和UBAP1的耗竭，以及作为负载对照的微管蛋白。（B）共聚焦免疫荧光显示，在用对照siRNA、TSG101-或UBAP1-特异性siRNA处理的细胞中，栓系蛋白、CD63和泛素定位。TSG101-和UBAP1-处理的面板显示了较高放大率的装箱区域。在覆盖面板中，DNA显示为蓝色，系链蛋白显示为绿色，CD63或泛素显示为红色。另请参阅表S3。

图4
UBAP1在ESCRT-I介导的HIV-1释放和细胞因子（A）感染性病毒释放中的作用：HIV-1前病毒与无关siRNA（Cont）、抗TSG101的siRNA或两种不同的抗UBAP1的siRNA共表达。Western blot显示细胞内TSG101、UBAP1和HSP90（蛋白质负载控制）以及细胞内（细胞裂解物）和病毒相关（病毒）HIV Gag蛋白。（B）用无关对照siRNA（Cont）、抗hIST1的siRNA（阳性对照）或两种不同的抗UBAP1的siRNA中的任何一种处理后，对多核细胞进行定量。至于（A），western blot显示siRNA介导的内源性hIST1、UBAP1和HSP90沉默作为蛋白质负荷控制。误差线表示与三个独立实验平均值的标准偏差。

图5
泛素与UBAP1的结合人UBAP1 SOUBA结构域（389–502）或包含UBAP1、ESCRT-I复合物的泛素结合物，由全长UBAP1，VPS28（全长），TSG101（198–390，即缺乏UEV结构域）和VPS37A（229–397，即缺少UEV结构区）组成。实验数据（正方形）使用一组独立位点的结合模型进行拟合。平均Kd和标准偏差由三个独立测量值计算得出。（A） ITC滴定含有UBAP1-SOUBA结构域（389-502）的细胞中的单泛素，温度图显示在顶部，积分峰显示在底部。（B） ITC滴定含有全长UBAP1的ESCRT-I细胞中的单泛素：温度图（顶部）和积分峰（底部）。（C）将SOUBA结构域滴定到含有K63双泛素的细胞中：温度图（顶部）和积分峰（底部）。（D）将SOUBA结构域滴定到含有K48双泛素的细胞中：温度图（顶部）和积分峰（底部）。

图6
重叠UBA构建紧凑的SOUBA域（a）UBAP1 SOUBA领域概述（389–502），显示三个重叠UBA域的串联排列，从N端（蓝色）到C端（红色）呈彩虹色。（B） UBAP1的三个UBA结构域中的每一个都与另外三个特征良好的UBA结构区进行序列比对。UBA标志性基序残基以红色显示，并在（A）中以棒状表示。SOUBA晶体结构中突变的残基显示为蓝色背景。（C）三个UBAP1 UBA域中的每个域与序列比对（B）中存在的三个先前报告的UBA域进行结构比对，即浅灰色的Ubiquilin1（2JY5）、中灰色的DSK2 UBA（2BWB）和深灰色的HHR23A UBA2（1DV0）。另见表1。

图7
核磁共振化学位移微扰法检测UBAP1与泛素的相互作用（A）¹⁵无标记UBAP1 SOUBA的2.5摩尔当量（黑色）和存在（红色）的N-标记单泛素。对具有显著化学位移变化的酰胺共振进行了注释。（B）化学位移扰动（CSP）图¹⁵N标记的泛素作为残基数的函数。脯氨酸残基（无可用数据）的赋值为0 ppm，并用星号标记。（C）单泛素的CSP映射到其结构上。（D） HSQC光谱叠加¹⁵在没有（黑色）和（红色）三摩尔当量的未标记泛素的情况下，使用N-标记的SOUBA。（E）的CSP图¹⁵N标记的SOUBA作为残数的函数。（F） SOUBA的CSP映射到其结构。（G–J）连接到K6C（G）和K48C（I）突变体泛素的自旋标记诱导的SOUBA/Ub复合物中的顺磁弛豫增强效应。该图绘制了添加SL-泛素后在SOUBA中观察到的实验PRE与残留数的关系。K6C-SL（H）和K48C-SL。K6和K48的侧链（突变为Cys用于自旋标记）显示为鲑鱼杆。

图8
泛素与UBAP1 SOUBA结合的模型UBA1、UBA2和UBA3分别为蓝色、黄色和红色。在与单泛素结合时显示CSP>0.2ppm的UBAP1残基显示为绿色棒。在每个UBA结构域与泛素复合物（PDB-ID2JY6号). 当CSPs与UBAP1 SOUBA结合时，CSPs>0.2 ppm的泛素残基显示为洋红色条。PRE和CSP测量表明，所有三种UBA都与泛素结合。泛素亚化学计量量的逐渐增加导致所有三个UBA基序中的残基发生化学位移，这表明泛素与一个位点的结合与另一个位点无关。核磁共振数据表明，结合发生在每个位点，但无法区分是一个、两个还是三个分子同时结合。然而，模型中似乎没有空间位阻冲突，这将阻止所有三种泛素同时结合。

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中的注释

UBAP1:新的ESCRT成员加入cl_Ub。
帕什科娃N，派珀RC。 Pashkova N等人。结构。2012年3月7日；20(3):383-5. doi:10.1016/j.str.2012.02.004。结构。2012 PMID：22404994 免费PMC文章。

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