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.2012年5月4日；287(19):15205-18.
doi:10.1074/jbc。M111.338665。 Epub 2012年3月7日。

两种保守的膜间隙蛋白Ups1p和Ups2p在线粒体内磷脂运输中的作用

田村安史 1, 欧马·翁古卡, 艾莉森·艾肯·霍布斯, 罗伯特·延森, 饭岛美穗, 史蒂芬·M·克莱普, Hiromi Sesaki先生
附属公司

两种保守的膜间隙蛋白Ups1p和Ups2p在线粒体内磷脂运输中的作用

田村安史等。 生物化学杂志. .

勘误表in

  • 生物化学杂志。2012年8月10日；287(33):27450

摘要

线粒体膜维持特定的磷脂组成。大多数磷脂在内质网（ER）中合成并运输到线粒体，但心磷脂和磷脂酰乙醇胺在线粒体中产生。在酿酒酵母中，ER和线粒体之间的磷脂交换依赖于ERMES复合物，它将内质网和线粒体外膜物理连接起来。然而，线粒体内磷脂转运所涉及的蛋白质和机制尚不清楚。在这里，我们研究了保守的膜间空间蛋白Ups1p和Ups2p以及内膜蛋白Mdm31p在磷脂代谢中的作用。我们的数据表明，ERMES复合物、Ups1p和Mdm31p的缺失会导致线粒体磷脂代谢、线粒体形态和细胞生长方面的类似缺陷。缺乏ERMES复合物或Ups1p的细胞缺陷被Mdm31p过度表达以及Ups2p的额外损失所抑制，Ups2p拮抗Ups1p。ERMES复合物和Ups1p的联合丢失加剧了磷脂缺陷。最后，使用[（14）C]丝氨酸的脉冲追逐实验表明，Ups1p和Ups2p拮抗调节磷脂酰乙醇胺向磷脂酰胆碱的转化。我们的结果表明，Ups蛋白和Mdm31p在线粒体磷脂生物合成中起着重要作用。Ups蛋白可能在线粒体内外膜之间的磷脂运输中起作用。

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数字

图1。
图1。
缺乏Ups蛋白或ERMES亚单位的线粒体磷脂组成发生改变。 A、，指示的酵母细胞在YPD中在32P（P）我从粗线粒体组分中提取磷脂并通过TLC分离。圆周率，磷脂酰肌醇。B、，测定每种脂质相对于总磷脂的含量，并在(重量)线粒体被设置为100%(红色虚线). 数值为平均值±S.E(n个= 3).
图2。
图2。
Ups2p缺失可改善ERMES缺失细胞的细胞生长和CL水平。 A、，将所示酵母细胞的系列稀释液置于YPD上，并在30°C下培养2天。B、，指示的酵母细胞在YPD中在32P（P）我从粗线粒体组分中提取磷脂并进行TLC分析。C、，测定了每种脂质相对于总磷脂的含量，并将ERMES缺失线粒体中检测到的含量设置为100%(例如mmm1Δ,毫米2Δ,mdm10型Δ，或中密度12Δ). 数值为平均值±S.E(n个= 3).圆周率，磷脂酰肌醇。
图3。
图3。
Ups1p和Ups2p的丢失会影响PE到PC的转换。 A、，细胞被脉冲标记[14C] 丝氨酸培养15分钟，并在指定的时间段内进一步培养。从细胞中提取总磷脂，并通过TLC和放射成像进行分析。15分钟时PS、PE和PC的总量设置为100%(总计). 在每个时间点测定PS、PE或PC相对于总量的比率。数值为平均值±S.E(n个= 3).B、，全细胞提取物由野生型和psd1级Δ细胞，用Yme1p和Psd1p抗体进行免疫印迹分析。C、，从指示细胞中分离线粒体，并用抗Psd1p、Tim23p和Tom22p抗体进行免疫印迹分析。
图4。
图4。
Mdm31p的过度表达可改善ERMES缺失细胞的细胞生长、CL丰度和线粒体形态。 A、 毫米1Δ,毫米2Δ,mdm10型Δ和中密度12Δ单元格URA3公司-携带相应基因的单拷贝质粒与TRP1号机组多拷贝向量窝藏MDM31型或MDM32型或空向量。将转化物划线到SCD-Trp+FOA板上，培养3天以去除URA3公司质粒。B、，全细胞提取物由千立方米Δ (上部面板)或千立方米Δ电池(下部面板)并用所示抗体进行免疫印迹分析。单拷贝转化细胞(欧洲标准化委员会)和多副本(2μ） 表达Mdm31p或Mdm32p的质粒。空白载体用作阴性对照。C、，将所示酵母细胞的系列稀释液涂在YPD和YPGE上，并分别培养2天和5天。D、，ERMES-deleted细胞，其中一个单拷贝质粒携带相应基因(MMM1型,百万平方米,MDM10型，或MDM12型)，一个空向量(矢量)或多拷贝质粒MDM31型(MDM31型)在YPD种植32P（P）我从粗线粒体组分中提取磷脂并进行TLC分析。测定了CL相对于总磷脂的量，并用野生型质粒从ERMES缺失的细胞中分离出线粒体中检测到的CL(例如MMM1,百万平方米,MDM10型，或MDM12型)设置为100%。E、，使用基质靶向Su9-GFP在指定细胞中观察线粒体。细胞在YPD中生长到对数期，并通过荧光显微镜和微分干涉显微镜进行检查。对含有管状线粒体的细胞进行评分。数值为平均值±S.E(n个= 3). 每个实验中至少检测100个细胞。酒吧，5微米。
图5。
图5。
Mdm31p膜拓扑分析。 A、，为了分析Mdm31p第二疏水区的功能，删除了该区域(马里兰州ΔTM（TM）). 为了确定Mdm31p的膜拓扑结构，在蛋白的两个不同位置引入3×FLAG标签。一个标签被插入到预序列之后，第二个标签被放置在第一个和第二个疏水域之间。此外，一种烟草蚀刻病毒(TEV公司)-在第二个3×FLAG标记之前引入了解理位点(Mdm31p-TEV-标志).B、，连续稀释千立方米Δ承载单个(欧洲标准化委员会)或多副本(2μ） 表达Mdm31p、Mdm31pΔTM的质粒(千立方米ΔTM（TM）)，标记-Mdm31p-TEV-FLAG(MDM31-TEV-FLAG标志)，或空向量(矢量)在YPD上发现并孵育1天。C、，从所示细胞中制备的全细胞提取物B类用所示抗体进行免疫印迹分析。D、，线粒体通过基质靶向Su9-GFP显示千立方米Δ细胞表达不同形式的Mdm31p。Mdm31pΔTM(千立方米ΔTM（TM）)由多拷贝质粒表达。E、，表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cox4p-TEV或Cyt的细胞的全细胞提取物c（c）1-使用抗FLAG抗体通过免疫印迹法分析TEV。F、，从表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cyt的细胞中分离线粒体c（c）1-TEV公司。OM和IM囊泡是通过渗透性休克和超声作用产生的。这些囊泡通过蔗糖密度梯度离心分离。使用针对所示蛋白质的抗体通过免疫印迹法分析每个组分的蛋白质。G、，表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cyt的分离线粒体c（c）1-TEV用0.1米钠2一氧化碳4通过超速离心分离上清液和颗粒组分。使用针对所示蛋白质的抗体通过免疫印迹分析蛋白质。C类和N个Mdm231p的C端和N端的一半。
图6。
图6。
Mdm31p过度表达可改善细胞生长、CL数量和线粒体形态向上1Δ单元。 A、，连续稀释向上1表达单拷贝质粒的Δ细胞UPS1型(UPS1型)，空向量(矢量)，表达Mdm31p的多拷贝质粒(MDM31型)，或Ups2p(通用产品2)在YPD上发现并在30°C下培养2天。B、，酵母细胞用于A类在YPD种植32P（P）我从粗线粒体组分中提取磷脂并通过TLC分离。测定了每种脂质相对于总磷脂的数量，以及从线粒体中检测到的磷脂数量向上1含有Ups1p质粒的Δ细胞设置为100%(例如UPS1). 数值为平均值±S.E(n个= 3).圆周率，磷脂酰肌醇。C、 向上1含有多拷贝质粒的Δ细胞MDM31型(MDM31型)或空向量(矢量)在YPD至对数阶段生长。使用基质靶向Su9-GFP观察线粒体。对含有管状线粒体的细胞进行评分。数值为平均值±S.E(n个= 3). 每个实验中至少检测100个细胞。酒吧，5微米。D、，连续稀释crd1型Δ和gep4基因携带多拷贝质粒的Δ细胞MDM31型(MDM31型)或通用产品2(通用产品2)，或空向量(矢量)，被发现在YPD上并生长了2天。
图7。
图7。
Ups2p过表达可部分修复细胞生长、CL水平和线粒体形态缺陷千立方米Δ单元。 A、 UPS1型,通用产品2，或MDM35型基因在中被删除千立方米Δ承载URA3公司携带MDM31型基因。将产生的酵母细胞转化为TRP1号机组单拷贝质粒包涵MDM31型或aTRP1号机组空向量。将这些细胞点在含有5′-FOA的SCD-Trp培养基上并孵育2天。B、，连续稀释千立方米携带表达Mdm31p的单拷贝质粒的Δ细胞(MDM31型)，表达Ups1p的多拷贝质粒(UPS1型)或Ups2p(通用产品2)，或空向量(矢量)在YPD上发现并生长2天。C、，酵母细胞用于B类在YPD种植32P（P）我从粗线粒体组分中提取磷脂并进行TLC分析。对每种脂质的量进行量化，并将其标准化为千立方米Δ线粒体表达Mdm31p。数值为平均值±S.E(n个= 3).圆周率，磷脂酰肌醇。D、，线粒体形态千立方米携带多拷贝质粒的Δ细胞通用产品2(通用产品2)或空向量(矢量)使用Su9-GFP进行可视化。观察前在YPD中培养细胞记录。对含有管状线粒体的细胞进行评分。数值为平均值±S.E(n个= 3). 每个实验中至少检测100个细胞。酒吧，5微米。
图8。
图8。
ER-mitochondria接触位点的形成不需要Ups1p、Ups2p和Mdm31p。 A、，GFP标记的Mmm1p(百万立方米-GFP)和线粒体靶向RFP(Su9-RFP（招标书）)以野生型表达，向上1Δ,向上2Δ和千立方米Δ单元。B、，GFP标记的Mmm2p(平方毫米-GFP)由质粒pMY3（33）在中密度12Δ细胞，其具有表达Mdm31p的多拷贝质粒或空载体。酒吧，5微米；DIC公司差分干涉对比度。
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