Systemic elevation of PTEN induces a tumor-suppressive metabolic state

doi:10.1016/j.cell.2012.02.030

。2012年3月30日；149(1):49-62.

doi:10.1016/j.cell.2012.02.030。 Epub 2012年3月6日。

PTEN系统性升高诱导肿瘤抑制代谢状态

伊莎贝尔·加西亚-Cao¹, Min Sup歌曲, 罗宾·霍布斯, 盖尔·洛朗, 卡洛塔·乔治, 文森特·德波尔, 迪米特里奥斯·阿纳斯塔西奥, 伊藤圭介, 佐佐木阿雄, 露西娅·拉梅赫, 阿尔凯茨·卡拉塞多, 马修·范德海登, 刘易斯·坎特利, 保罗·平顿, 马西娅·海吉斯, 保罗·潘多尔菲码头

附属公司

PMID： 22401813
预防性维修识别码： PMC3319228型
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2012.02.030

PTEN系统性升高诱导肿瘤抑制代谢状态

伊莎贝尔·加西亚-Cao等。单元格。 2012。

。2012年3月30日；149(1):49-62.

doi:10.1016/j.cell.2012.02.030。 Epub 2012年3月6日。

作者

伊莎贝尔·加西亚-Cao¹, Min Sup歌曲, 罗宾·霍布斯, 盖尔·洛朗, 卡洛塔·乔治, 文森特·德波尔, 迪米特里奥斯·阿纳斯塔西奥, 伊藤圭介, 佐佐木忠雄, 露西娅·拉梅赫, Arkaitz Carracedo公司, 马修·范德·海登, 刘易斯·坎特利, 保罗·平顿, 马西娅·海吉斯, 保罗·潘多尔菲码头

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学部癌症遗传学项目，邮编02215。

PMID： 22401813
预防性维修识别码： PMC3319228型
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2012.02.030

摘要

PTEN的减少性丢失导致癌症易感性和肿瘤进展。因此，PTEN升高可能是癌症预防和治疗的一个有吸引力的选择。利用细菌人工染色体（BAC）介导的转基因，我们已经产生了几种PTEN表达提高到不同水平的转基因小鼠系。“超级PTEN”突变体是可行的，并且由于细胞数量减少而显示出体型缩小，而对细胞大小没有影响。出乎意料的是，PTEN在生物体水平的升高导致健康的新陈代谢，其特点是增加能量消耗，减少体脂积累。来自这些小鼠的细胞表现出葡萄糖和谷氨酰胺摄取减少，线粒体氧化磷酸化增加，并且对致癌转化具有抵抗力。我们发现PTEN升高通过调节PI3K依赖性和独立性通路来协调这种代谢转换，并对肿瘤细胞最显著的两个代谢特征产生负面影响：谷氨酰胺分解和Warburg效应。

PubMed免责声明

数字

**图1。Super-PTEN小鼠的产生**
一，BAC RP23-215F15克隆携带的基因组插入图（RPCI文库，C57BL/6J），用于生成PTEN基因剂量增加的小鼠（“Super-PTEN”小鼠）。基因组插入物长218.50 Kb，包含整个铂族位点（红色方框表示PTEN编码序列）。灰色线表示BAC矢量（pBACe3.6）序列。使用AscI对BAC克隆进行线性化。显示了用于检测转基因的引物（T7侧：F1，R1；SP6侧：F2，R2）。b条，不同BAC-PTEN转基因株系PTEN水平的量化。从每个品系获得MEF，并用PTEN和β-肌动蛋白抗体检测总蛋白裂解物。该图显示了每一转基因株系中PTEN水平相对于野生型同窝产仔的倍数增加。**c、，**来自tg无表达（第1行）、中等表达（第2行）或高表达（第3行）的MEF的代表性免疫印迹。**d中，**性交后13.5天采集的wt和tg胚胎的代表性图像。注意，与体重相比，tg胚胎的体型减小。**e、，**Western blot显示PTEN在胚胎发生期间和成年小鼠组织中的表达（第3行的wt和tg）*就心脏而言，考马斯曲线显示为负荷控制。**f、，**Western blot显示来自wt和tg MEFs的细胞质（C）和核（N）提取物中的PTEN水平（第3行）。克，PTEN在wt和tg小鼠组织中的免疫组织化学表达（第3行）。

**图2。Super-PTEN状态与生命相容，但由于细胞数量减少，导致器官尺寸减小**
**a、，**生长曲线表明PTEN过度表达导致体重减轻。注意，随着PTEN剂量的增加，这种影响更为严重。**b、，**Western blot显示来自不同PTEN转基因株系的不同组织（脾、肝）中的PTEN水平（株系1：1.2倍；株系2：2倍；株株3：高于内源性PTEN水平3.5倍）。**c、，**PTEN过度表达对体型的影响（第3行）。**d中，**从Super-PTEN和野生型小鼠分离的器官中的细胞数量和细胞大小（第3行，每个基因型3个）。FSC=前向散射。CD4/8细胞：CD4⁺/镉8⁺，KSL单元格：Lin^负极/c试剂盒⁺/Sca-1型⁺，AT2细胞：Sca1^负极/CD45型^负极/PECAM公司^负极/Autofl（自动飞行）^你好，B电池：B220^中+/免疫球蛋白M^中+中的错误栏一和d日表示s.d.参见图S1。

**图3。PTEN过度表达导致培养物中生长速度降低，对致癌细胞转化产生抵抗，c-Myc水平降低，并赋予癌症抵抗力体内**
**a、，**wt和tg MEF的生长曲线（每个基因型3个）。**b、，**初级wt和tg MEF的3T3系列培养（n=3）。图中显示了每个通道的累积种群倍增（PDL）。**c、，**wt和tg MEF的集落形成效率（n=4）。**d中，**wt和tg MEF的转化敏感性（n=4）。图片显示了转染致癌Ras和E1A后形成的肿瘤灶数量。**e、，**对3MC诱导的纤维肉瘤的敏感性。将3MC肌肉注射到指定基因型的小鼠的一条后腿，并对纤维肉瘤发生的潜伏期进行评分（第3行，每个基因型5个）。根据Gehan-Breslow-Wilcoxon试验确定，Super-PTEN小鼠发生肿瘤的潜伏期明显长于野生型小鼠（*p<0.05）。Western blot显示PTEN在野生型和Super-PTEN小鼠肿瘤中的表达水平。**f、，**由E1A+Ras（顶部）或cMyc+E1A+Ras（底部）转化的初级MEF中的软琼脂分析。该图显示了每个孔的菌落数（六孔板，三份样品）。显示了化验的代表性图片。克，来自wt和tg MEF和组织的蛋白质裂解物的免疫印迹。用抗c-Myc、PTEN和β-actin抗体检测总细胞提取物。中的误差线一,b条,**c（c）**,d日和如果表示s.d.参见图S2。

**图4。Super-PTEN小鼠的能量消耗增加**
**a、，**通过EchoMRI（第3行）测定年轻小鼠（左侧：wtn=7；tgn=7）和老年小鼠（右侧：wtn=12；tgn=10）的脂肪和瘦肉质量百分比。b条，Super PTEN（红线）和野生型小鼠（黑线）的间接量热法。耗氧量（VO2）、二氧化碳释放量（VCO2）、呼吸交换比（RER；VCO₂/VO（旁白）₂)在代谢室中测定Super PTEN和野生型小鼠每公斤体重的能量消耗（品系3，每个基因型n=4）。**c、，**wt（n=10）和tg（n=9）小鼠（第3行）的血清乳酸水平。中的误差线一表示s.d。；中的误差线b条表示s.e.m.参见图S3。

**图5。PTEN过度表达导致线粒体耗氧量、线粒体ATP生成和线粒体数量增加**
**a、，**在基础条件下以及添加寡霉素、FCCP和鱼藤酮后，测量初级体重和tg MEF（每个基因型3个）的OCR（耗氧率）（Seahorse XF24分析仪）。**b、，**如方法部分所述，激动剂刺激后wt和tg MEF的线粒体ATP生成。如有指示，用100µM ATP处理细胞。数据表示为初始值的百分比。重量：162±8%；tg:251±18%。三个独立实验的n=15，p<0.05（平均值±标准误差）。**c、，**线粒体钙²⁺激动剂刺激后的体内平衡测量如方法部分所述。如有指示，用100µM ATP处理细胞。重量：[钙²⁺]_米峰值155±8µM。tg:[钙²⁺]_米峰值131±5µM。n=12，来自三个独立实验（平均值±s.e.m）。**d中，**线粒体膜电位分析（ΔΨ_米)单位为wt和tg MEF。如方法部分所述，加载TMRM的单元格。当用FCCP处理指示细胞时，ΔΨ完全崩解_米记录道代表单细胞反应（wt n=28；tg n=33）。**e、，**方法部分所述的线粒体总体积和单个体积以及线粒体数量分析（wt n=43；tg n=40，来自三个独立实验，p<0.05）。线粒体靶向GFP可视化显示wt和tg MEF中的线粒体形态。如方法部分所述，计算线粒体断裂指数（wtn=43；tg n=40，来自三个独立实验）。网络体积图、平均线粒体体积图和线粒体数图的纵坐标分别为体素/细胞、体素/物体和N°物体/细胞。中的误差线一表示s.d。；中的误差线d日,**e（电子）**表示s.e.m.参见图S4。

**图6。PTEN升高通过调节PI3K依赖和独立通路诱导肿瘤抑制代谢状态**
**a、，**在wt和tg细胞（n=2）中测量培养基中的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺水平，并将其标准化为细胞数。**b中，**mTORC1和PI3K/Akt通路的药理抑制对糖酵解酶和谷氨酸解酶的影响。用二甲基亚砜（续）、20 nM雷帕霉素（Rapa.）处理24 h或100 nM沃特曼（Wort.）处理8 h的wt和tg MEF的细胞裂解液，用PKM2、PFKFB3、GLS、p-S6、S6、p-Akt、Akt，PTEN和β-actin抗体进行免疫印迹。**c、，**的影响*Tsc2型*PKM2蛋白水平上消耗介导的mTORC1激活。GL3-shRNA的细胞裂解物（对照荧光素酶基因的shRNA）和*Tsc2型*-用PKM2、Tsc2、PTEN和²-actin抗体对shRNA感染的wt和tg-MEFs进行免疫印迹。**d中，**折叠变化率（tg与wt）通过qRT-PCR测定来自wt和tg MEF的总RNA的PTEN、FKFB3和GLS mRNA水平(左边)。蛋白酶体介导的GLS和PFKFB3降解。用10µM蛋白酶体抑制剂MG132处理来自wt和tg MEF的细胞裂解液4小时，用GLS、PFKFB3、PTEN和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹(*正确的*).e、，PFKFB3过度表达对E1A+Ras转化的原代MEF中细胞生长（电镀后48小时）的影响。显示了相对于wt MEFs+E1A+Ras的增长百分比。**f、，**PTEN增强APC/C-Cdh1介导的GLS泛素化。*PTEN公司*-将缺失的PC-3细胞与GLS、His-ubiquitin（Ub）、CDH1和PTEN联合转染，并在收获前用MG132（10µM）处理4小时。使用镍从细胞裂解液中纯化His-Ub共轭GLS²⁺-变性条件下的NTA自旋柱。克， *加拿大存托凭证1*-沉默可恢复tg MEF中GLS和PFKFB3的水平。转染siRNAs的wt和tg MEF的细胞裂解物*雷尼利亚*荧光素酶（siCont.）或*加拿大存托凭证1*用GLS、PFKFB3、PTEN、Cdh1和²-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。**小时，**菌落数（倍数变化率：tg与wt MEFs+Ras）在软糖分析中形成*Tsc2型*或*加拿大存托凭证1*由致癌Ras转化的永生化MEF中的基因敲除。该图显示了每个孔的菌落数（六孔板，三份样品）。中的误差线一,d日,**e（电子）**和小时表示s.d.参见图S5。

**图7。PTEN通过调节PI3K依赖和独立通路诱导肿瘤抑制代谢状态**
PTEN升高对肿瘤细胞两个最显著的代谢特征产生负面影响的模型：谷氨酸分解和Warburg效应。

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