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比较研究
.2012年2月29日；32(9):3044-57.
doi:10.1523/JNEUROSCI.6409-11.2012。

基质金属蛋白酶-2介导的闭塞素降解和小窝蛋白-1介导的克劳丁-5再分布在缺血性卒中早期血脑屏障损伤中的作用

刘杰（音译） 1, 金新春, 刘柯（Ke J Liu）, 刘文澜
附属公司
比较研究

基质金属蛋白酶-2介导的闭塞素降解和小窝蛋白-1介导的克劳丁-5再分布在缺血性卒中早期血脑屏障损伤中的作用

刘杰（音译）等。 神经科学. .

摘要

血脑屏障（BBB）的破坏发生得足够早，在溶栓时间窗内，这种早期缺血性BBB损伤与出血性转化密切相关，因此成为减少溶栓性卒中治疗出血并发症的一个有希望的靶点。然而，早期缺血性BBB损伤的机制尚不清楚。在这里，我们使用体外氧-葡萄糖剥夺（OGD）和体内大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型研究了缺血性BBB损伤的早期分子事件。bEND3单层暴露于OGD 2 h显著增加其对FITC-标记葡聚糖的通透性，并促进金属蛋白酶-2和-9（MMP-2/9）的分泌和小窝蛋白-1（Cav-1）的细胞溶质移位。同样的OGD治疗也导致紧密连接蛋白闭塞素的快速降解和克劳丁-5从细胞骨架中分离，这有助于OGD诱导的内皮屏障破坏。使用选择性MMP-2/9抑制剂SB-3CT（2-[[（4-苯氧基苯基）磺酰基]甲基]-噻吩）或其中和抗体或Cav-1 siRNA，我们发现MMP-2是介导OGD诱导的闭塞素降解的主要酶，而Cav-1负责克劳丁-5的重分布。通过共免疫沉淀进一步证实了Cav-1和claudin-5之间的相互作用。与这些体外研究结果一致，我们观察到荧光示踪剂外渗，凝胶溶解活性增加，缺血皮层下组织在2小时MCAO后间质MMP-2水平升高。此外，在缺血脑微血管中检测到闭塞蛋白丢失和克劳丁-5重新分布。这些数据表明，脑缺血启动了两个快速平行过程，即MMP-2介导的闭塞素降解和Cav-1介导的克劳丁-5再分布，导致与急性溶栓相关的卒中早期BBB中断。

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数字

图1。
图1。
缺血导致BBB快速破坏在体外和体内.A类，顶部面板，的示意图在体外血脑屏障模型（在插入物上生长的bEND3单层），在管腔室中负载FITC-葡聚糖。底部面板，通过计算FITC-右旋糖酐从管腔室到管腔室的转移率来评估内皮单层通透性，并表示为表观通透性系数（Papp）（单位：厘米每秒）。bEND3单层暴露于OGD 2 h显著增加其对FITC-右旋糖酐的渗透性*第页<0.05与对照文化，学生t吨测试；n个= 6.B类，脑缺血迅速导致所有受试大鼠缺血脑中BBB的破坏(n个= 6). 四只不同大鼠脑冷冻切片的代表性荧光显微照片显示，2h MCAO在缺血半球皮层下区域诱导FITC-白蛋白外渗（亮绿色荧光）。在其他脑区未观察到FITC-白蛋白泄漏。误差条表示SEM。
图2。
图2。
OGD诱导bEND3细胞中闭塞素的快速降解和克劳丁-5的重新分布。将bEND3细胞暴露于OGD 2 h后，制备总细胞裂解物和亚细胞组分提取物，并对紧密连接蛋白cloudin和claudin-5进行Western blot分析。作为负荷控制，剥离印迹并用β-肌动蛋白抗体进行复制。A类,B类2小时OGD可显著降低总闭塞蛋白水平，但不会改变克劳丁-5的总蛋白水平。C类OGD诱导了claudin-5在亚细胞隔室之间的再分配，表现为ACF中claudin-5-水平显著降低，CF和MF中claudin-5水平显著增加。CF的印迹被剥离并用β-actin抗体重制。D类用抗钙蛋白酶（CF）、抗半胱氨酸（MF）和抗波形蛋白（ACF）抗体证实了每个组分的特异性*第页<0.05与对照，学生t吨测试；n个= 4. 误差条表示SEM。
图3。
图3。
OGD诱导的闭塞素降解依赖于MMP-2/9。A类，OGD使条件培养液中MMP-2/9水平迅速升高。将bEND3细胞暴露于OGD 2 h后，与对照培养物（Ctrl）相比，明胶酶谱条件培养液中的MMP-2/9水平显著增加。酶谱凝胶上观察到活性MMP-2（底部带），但没有活性MMP-9。MMP-2或-9水平通过测量其潜伏带和活性带的总强度来量化*第页<0.05与Ctrl，学生的t吨测试；n个= 5. 标准，标准人类MMP-2/9。B类，选择性MMP-2/9抑制剂SB-3CT完全抑制OGD诱导的闭塞素降解。用SB-3CT（10μ米)OGD前2小时和2小时内。用蛋白质印迹法检测总细胞提取物中的Occludin蛋白。β-肌动蛋白作为负荷控制*第页<0.05与车辆（DMSO）加上控制，#第页<0.05与溶媒加OGD，方差分析；n个= 5.C类MMP-2中和抗体（M2）完全抑制OGD诱导的闭塞素降解，而对IgG或MMP-9中和抗体（M9）无明显影响。在2小时OGD期间，用20μg/ml的对照小鼠IgG、MMP-2或MMP-9中和抗体或两者（M2、9）处理bEND3细胞。用蛋白质印迹法检测总细胞提取物中的Occludin蛋白。β-肌动蛋白作为负荷控制*第页<0.05与对照组（Ctrl），#第页<0.05 vs OGD单独（−）或OGD加IgG，ANOVA；n个= 4.D类，典型的共焦显微照片显示闭塞素的MMP依赖性降解。对照bEND3细胞显示闭塞素的细胞外免疫染色，在将细胞暴露于OGD中2 h后显著降低。SB-3CT处理完全抑制了OGD处理细胞中闭塞素的降低。实验重复了三次，结果相似。比例尺，20μm。E类SB-3CT抑制MMP-2/9对OGD诱导的claudin-5再分布没有影响。用Western blot检测亚细胞组分中的Claudin-5蛋白*第页<0.05与车辆加Ctrl，方差分析；n个= 5. 误差条表示SEM。
图4。
图4。
OGD通过促进细胞外基质金属蛋白酶-2/9从bEND3细胞中预先存在的细胞内池中分泌来提高其水平。A类明胶酶谱分析显示，2h OGD显著增加CM中MMP-2/9的水平，同时伴随着整个CE中MMP-2/9水平的显著降低*第页<0.05与对照，学生t吨测试；n个= 5. 标准，人类MMP-2/9标准。B类实时RT-PCR分析显示，2 h OGD未改变bEND3细胞中MMP-2/9 mRNA的表达。n个= 5.C类,D类，Act D抑制mRNA合成或CHX抑制蛋白合成对OGD诱导的bEND3细胞MMP-2/9分泌没有显著影响。在OGD治疗前1 h和治疗2 h期间，用Act D（2μg/ml）或CHX（100μg/ml）或载体（DMSO）处理细胞*第页<0.05与对照组（Ctrl），方差分析；n个= 5.E类，2小时OGD还刺激星形细胞系C8-D1A（左图）和神经元细胞系SH-SY5Y（右图）分泌MMP-2/9，表现为CM中MMP-2/9的增加和CE中MMP-2/9水平的同时降低。实验重复了四次，结果相似。误差条表示SEM。
图5。
图5。
Cav-1介导OGD诱导的claudin-5从内皮细胞的细胞骨架中分离。A类,B类Western blot分析表明，将bEND3细胞暴露于OGD 2 h对Cav-1的总蛋白水平没有影响，但触发了其在亚细胞组分之间的重新分布，这反映在CF中Cav-1水平增加而ACF中Cav-2水平降低*第页<0.05与对照，学生t吨测试；n个= 5.C类，Cav-1 siRNA有效地抑制了bEND3细胞中Cav-1蛋白的表达。Western blot分析表明，用Cav-1 siRNA（Cav-1-siR）孵育细胞48小时后，Cav-1蛋白水平显著降低（～90%）*第页<0.05与对照siRNA（Ctrl-siR），学生t吨测试；n个= 5.D类，用siRNA敲低Cav-1可阻止OGD诱导的claudin-5在bEND3细胞中的再分配。OGD处理后，CF、MF中的claudin-5水平升高，而ACF中的claudin-5水平显著降低，这一点受到Cav-1 siRNA的抑制*第页<0.05与对照组（Ctrl）；#第页<0.05与Ctrl-siR加OGD，ANOVA相比；n个= 5.E类，代表性的共聚焦显微镜图像显示对照bEND3细胞中claudin-5的细胞周免疫染色。两小时OGD治疗并没有改变claudin-5的免疫染色强度，但显著扰乱了其正常分布模式。用siRNA敲低Cav-1抑制OGD诱导的claudin-5再分布。实验重复了三次，结果相似。比例尺，20μm。F类，Cav-1和claudin-5从对照培养物的全细胞裂解物或OGD处理的细胞与抗Cav-1抗体或正常IgG共免疫沉淀的代表性免疫印迹（顶面板）。底部面板，OGD增强了Cav-1与claudin-5的相互作用*第页<0.05与对照，学生t吨测试；n个= 4. 误差条表示SEM。
图6。
图6。
SB-3CT抑制MMP-2/9或siRNA敲除Cav-1减少OGD诱导的BBB破坏在体外暴露于OGD 2h后，FITC-右旋糖酐对bEND3单层的通透性显著增加，用MMP-2/9抑制剂SB3-CT或Cav-1 siRNA预处理细胞可部分抑制其通透性。SB-3CT和Cav-1 siRNA的结合可完全保持OGD处理内皮单层的内皮屏障完整性。通过计算FITC-右旋糖酐从腔室到腔室的转移率来评估内皮单层通透性，并用表观通透性系数（Papp）表示（厘米每秒）*第页与对照组相比<0.05；#第页<0.05，与车载-OGD培养相比；φ第页<0.05与对照siRNA（Ctrl-siR）加OGD相比；&第页<0.05与Cav-1 siRNA（Cav-1 siR）加OGD或SB-3CT加OGD相比，方差分析；n个= 6. 误差条表示SEM。
图7。
图7。
脑缺血迅速增加缺血纹状体细胞外MMP-2/9水平及其活性。MCAO 2 h后，通过以下方法分析MMP-2/9的胶溶活性及其细胞外水平就地酶谱和微透析取样/凝胶酶谱。A类,现场对注射德克萨斯红蛋白的脑组织冰冻切片进行酶谱分析。在缺血纹状体组织（亮绿色荧光）中发现MMP-2/9的胶溶活性增加，同时出现德克萨斯州红白蛋白渗漏。在相应的非缺血纹状体组织中未发现示踪剂渗漏和较弱的凝胶溶解活性。比例尺，50μm。实验重复了四次，结果相似。B类，原理图体内微透析取样，在2h MCAO期间采集非缺血（Non-I）和缺血（I）纹状体间质中的MMP-2/9。C类收集的透析液的凝胶明胶酶谱分析显示，MMP-2/9，尤其是MMP-2在缺血纹状体间质空间显著增加*第页<0.05与非I，学生t吨测试；n个= 4.D类，缺血纹状体组织中MMP-2/9mRNA的表达在MCAO 2小时后没有改变(n个= 6). 从非缺血和缺血纹状体组织中提取总RNA，并通过实时RT-PCR分析mRNA表达。误差条表示SEM。
图8。
图8。
脑缺血诱导闭塞素快速降解和克劳丁-5再分布体内MCAO 2h后，用IHC或Western blot分析脑微血管中闭塞素和克劳丁-5的蛋白水平。A类,B类在注射德克萨斯红蛋白的脑组织冰冻切片上进行闭塞素和克劳丁-5的免疫染色。在非缺血组织的微血管上可以清楚地看到闭塞素和克劳丁-5的免疫染色（绿色），在那里没有观察到德克萨斯州红蛋白渗漏。在缺血半球，微血管上的示踪剂渗漏伴随着闭塞素染色减少，而克劳丁-5染色没有明显变化。比例尺，25μm。实验重复了四次，结果相似。C类,D类脑缺血2h后，从非缺血（Non-I）和缺血（I）半球组织中分离出脑微血管。制备微血管总提取物和亚细胞组分，用Western blot分析闭塞素和克劳丁-5蛋白水平。作为负荷控制，剥离印迹并用β-肌动蛋白抗体进行复制。MCAO诱导微血管总提取物中闭塞素水平显著降低(C类). *第页<0.05与非I，学生t吨测试；n个= 6. MCAO并未改变脑微血管提取物中的总克劳丁-5水平（左上图），但导致ACF中克劳丁-5的水平显著降低，而CF和MF（右上图和右下图）的水平显著升高*第页<0.05与非I，学生t吨测试；n个= 4. 误差条表示SEM。
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