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.2012年5月；25(3):375-83.
doi:10.1111/j.1755-148X.2012.00989.x。 Epub 2012年3月27日。

低氧黑色素瘤细胞的脂肪生成需要通过异柠檬酸脱氢酶1和2逆转TCA循环流量

费边·菲利普 1, 大卫·A·斯科特, 泽耶夫·A·罗奈, 安德烈·奥斯特曼, 杰弗里·史密斯
附属公司

低氧黑色素瘤细胞的脂肪生成需要通过异柠檬酸脱氢酶1和2逆转TCA循环流量

费边·菲利普等。 色素细胞黑素瘤研究. 2012年5月.

摘要

三羧酸（TCA）循环是氧化代谢的中心枢纽，以经典的正向运行，为生物合成提供碳，为生成ATP提供还原剂。我们对黑色素瘤细胞的代谢示踪剂研究表明，在缺氧条件下，TCA循环与糖酵解基本断开。通过研究TCA支点代谢物乙酰辅酶a和柠檬酸盐，以及代谢终点谷氨酰胺和脂肪酸，我们对缺氧时发生的TCA循环的重组形成了一个全面的图景。缺氧肿瘤细胞通过反向运行TCA循环来维持增殖。乙酰辅酶A、柠檬酸盐和脂肪酸的碳源从常氧状态下的葡萄糖转换为缺氧状态下的谷氨酰胺。这种从谷氨酰胺到脂肪酸的低氧通量是由还原羧基化介导的。这种还原羧基化反应由两种异柠檬酸脱氢酶IDH1和IDH2催化。它们的联合作用是必要的，足以影响反向TCA流量并保持细胞活力。

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数字

图1
图1。通过TCA循环的正向（氧化）和反向（还原）通量
正向（红色）和反向（蓝色）运行的TCA循环模型。
图2
图2。谷氨酰胺补偿低氧时进入乙酰辅酶A池的低糖酵解通量
通过核磁共振波谱在H3A黑素细胞、WM35和LU1205黑色素瘤细胞中测定乙酰辅酶A（A）、柠檬酸（B）、脂肪酸（C）和甘油（D）在常氧（红色，NMX=21%O2)和缺氧（蓝色，HPX=1%O2). 输入底物为50%[U-13C] -标记葡萄糖（空白条）或谷氨酰胺（填充条）。进入特定代谢物的通量表示为代谢物标记除以输入底物标记。在氯仿提取代谢物的脂质部分中检测到甘油磷脂的甘油头部基团，并用作脂质中稳定同位素掺入的样品内对照。信号是全部的平均值1H、，13C观察到的代谢物的可检测碳。具体来说，这些是乙酰辅酶A的碳2、柠檬酸的碳2和碳4、甘油的碳1-3以及脂肪酸的碳2-7、ω-2、ω-1和ω。
图3
图3。碳连接性揭示了谷氨酰胺到柠檬酸盐的反向（还原）通量
A） 柠檬酸盐可用作报告代谢物，用于定量和比较正向（氧化）通量与反向（还原）通量。当柠檬酸盐的通量主要是正向流动时（黑色箭头，左图），柠檬酸盐（眼睛符号）的碳C2主要来源于乙酰-CoA单元，当它们与草酰乙酸缩合时。在这种情况下，C1和C2有一个共同的起源（乙酰辅酶a的黑色阴影），但与分子的其他部分不同。相反，当柠檬酸主要来自谷氨酰胺的反向（还原）通量时，C1到C5都有相同的来源（谷氨酰胺的蓝色阴影）。当碳被同位素标记时，C2的核磁共振谱可以区分和量化这两种可能性。B） WM35细胞在常氧和缺氧条件下柠檬酸碳C2的核磁共振波谱（左图）。在这两种光谱中，由C1到C2的连锁（共同起源）产生的偶极子信号仅显示为黑色，而由标记碳（共同来源）的连锁产生的偶极子信号显示为常氧（红色）和缺氧（蓝色）。缺氧时，彩色信号比黑色信号高，表明谷氨酰胺在TCA循环中从正向通量向反向通量转变。C） 通过反向（还原）通量，从谷氨酰胺中产生的柠檬酸的分数是根据双重态与单重态和双重态的比值计算得出的。结果显示H3A黑素细胞、WM35和LU1205黑色素瘤在常氧（NMX，红色）和缺氧（HPX，蓝色）下的表现。
图4
图4。敲除IDH1和IDH2可减少缺氧时的反向还原流量
在低氧状态下的LU1205细胞中，测定了IDH1和IDH2的siRNA敲低对反向TCA循环流量的影响。（A） 反向TCA循环流量被确定为还原羧基化为柠檬酸盐，并作为通过还原或氧化TCA循环输入柠檬酸盐总量的相对测量值。通过使用草酰乙酸和乙酰辅酶A质量分布计算柠檬酸的相对输入，以及谷氨酸质量分布和未标记CO2用于反向输入。的数据是GCMS重复测定的平均值。（B） 受IDH亚型敲除影响的LU1205黑色素瘤细胞中来自谷氨酰胺的代谢物百分比。数据表示13代谢物中所有碳原子平均代谢物的C标记除以50%[U-13C] 输入谷氨酰胺标记。
图5
图5。IDH1和IDH2是缺氧时反向还原通量的载体
通过核磁共振波谱监测低氧条件下WM35细胞中IDH1、IDH2及其组合的siRNA敲低的效果。（A） 谷氨酰胺转化为脂肪酸的流量是以输入谷氨酰胺在碳2-7、ω-2、ω-1和ω饱和脂肪酸中衍生出的脂肪酸百分比来测量的。稳定同位素标记的测量百分比除以50%[U-13C] 标记输入碳源，以获得显示的通量值。（B） 细胞活力通过3-（4,5-二甲基噻嗪-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑盐（MTS）测定法在96孔培养皿中的吸光度测量，一式三份，并相对于用扰乱的siRNA转染的WM35细胞培养物报道。（C）进入谷氨酸的流量是以谷氨酰胺代谢物的百分比来衡量的，考虑到50%[U-13C] 输入碳源的标记。（D） 以微管蛋白水平作为负荷控制，通过Western blot定量每个IDH的敲除效率。
图6
图6。黑色素瘤细胞株的轮廓显示谷氨酰胺通过还原羧基化转化为脂肪酸
（A） 谷氨酰胺摄入。（B） 通过反向（还原）TCA循环路线从[U合成的柠檬酸的相对分数-13C] -谷氨酰胺与正常氧和缺氧条件下的细胞进行比较，数据归一化为正常氧值。（C） 来自[U的通量-13C] -谷氨酰胺转化为乙酰辅酶A单位，存在于常氧（NMX）和缺氧（HPX）条件下的脂肪酸中。50%[U的稳定同位素掺入-13C] -谷氨酰胺通过GCMS测定。
图7
图7。碳连接性揭示了缺氧时反向（还原性）TCA通量：脂肪酸合成通过IDH1和IDH2进行
在常氧（A）条件下，葡萄糖（红色）的流量为正向的TCA循环和脂肪酸合成的乙酰辅酶A池提供营养。缺氧（B）时，缺氧诱导因子1a阻断TCA循环的流量。谷氨酰胺（蓝色）的流量补偿了乙酰辅酶A的有限供应，并促进了脂肪酸的生物合成。IDH1和IDH2与前向TCA循环活动解耦；它们通过反向运行TCA循环提供了捷径。IDH从酮戊二酸盐到异柠檬酸盐的反方向称为还原羧基化。基于核磁共振的碳连接性监测通量和稳定同位素掺入。
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