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.2012年4月15日；125（第8部分）：1920-8。
doi:10.1242/jcs.094219。 Epub 2012年2月17日。

Vam6和Gtr1-Gtr2途径激活TORC1以响应裂变酵母中的氨基酸

诺埃利亚·瓦尔布埃纳 1, 关坤良, 塞尔吉奥·莫雷诺
附属公司

Vam6和Gtr1-Gtr2途径激活TORC1以响应裂变酵母中的氨基酸

诺埃利亚·瓦尔布埃纳等。 细胞科学杂志. .

摘要

GTPases的Rag家族与果蝇和哺乳动物细胞对氨基酸的TORC1激活有关。我们研究了Rag GTPases Gtr1和Gtr2在裂殖酵母TORC1调控中的作用。裂变酵母Gtr1和Gtr2是在培养基中存在氨基酸的情况下促进细胞生长的非必需蛋白质。Gtr1和Gtr2在营养信号传递中的功能得到了进一步的支持，这一观察结果表明，即使在富含营养的培养基中，任一基因的缺失也会导致交配、减数分裂和孢子形成的促进，这与TORC1的下调相一致。我们发现Gtr1和Gtr2在液泡中与TORC1共定位，TORC1可能在液泡激活。表观分析表明，Gtr1和Gtr2在Vam6下游和TORC1上游对氨基酸信号起反应。我们的数据表明存在进化保守的途径，Vam6和Gtr1-Gtr2途径激活TORC1，从而刺激细胞生长并抑制性分化。

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数字

图1。
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Gtr1和Gtr2在细胞生长和性分化中的作用。(A类)野生型(重量),全球技术法规1Δ和全球技术法规2Δ细胞在30°C的爱丁堡最小培养基（EMM）中生长，然后转移到新鲜EMM和添加氨基酸的EMM中。同时，表1-32，全球技术法规1Δ鲁1-32和全球技术法规2Δ鲁1-32细胞在补充有亮氨酸的EMM中生长。该实验进行了三次，每2小时计算一次每毫升的细胞数，以计算倍增时间。(B类)全球技术法规1Δ和gtr2型将相反交配类型的Δ细胞在25°C的YES平板上培养2天。这个全球技术法规1Δ和全球技术法规2Δ突变体细胞能够在丰富的培养基中交配并形成孢子。比例尺：10μm。(C类)通过计算YES平板中观察到的合子数量来确定富培养基中的交配效率。
图2。
图2。
Gtr1和Gtr2的亚细胞定位。(A类)全球技术法规1-gfp和全球技术法规2-rfp细胞在30°C的EMM中在有氨基酸和无氨基酸的情况下生长。Gtr1–GFP和Gtr2–RFP定位于与液泡膜类似的结构，与氨基酸的存在无关。(B类)全球技术法规1-gfp细胞在30°C的EMM中生长，用FM4-64染色鉴定液泡并证实Gtr1-GFP定位于液泡膜。(C类)在氨基酸存在和不存在的情况下，Gtr1–GFP和Gtr2–RFP共同定位于液泡表面。(天)gtr1-flag、gtr2-rfp和gtr1-flag gtr2-rfp细胞在30°C的EMM中生长，并在有氨基酸和无氨基酸的情况下转移到EMM中。1小时后收集指数生长的细胞，并使用抗Flag M2珠将细胞裂解物拉下。Gtr1–Flag与Gtr2–RFP发生物理相互作用，并且这种相互作用在氨基酸存在时增加。使用ImageJ软件通过密度测定法估计Gtr1–Flag和Gtr2–RFP之间的相对相互作用，并将其归一化为在氨基酸存在的情况下用抗Flag抗体拉下的Gtr2-RFP数量，设置为1。比例尺：10μm。
图3。
图3。
TORC1的亚细胞定位。 gfp-tor2，pop3-gfp和绿色荧光蛋白-mip1细胞在含有硫胺（EMMT）的EMM中在30°C下生长，并用(A类)不含氨基酸(B类). 细胞用FM4-64染色观察液泡膜。TORC1复合物的三个亚基（GFP–Tor2、Pop3–GFP和GFP–Mip1）定位于液泡膜。比例尺：10μm。
图4。
图4。
TORC1和Gtr1在体内相互作用。(A类)野生型(重量),全球技术法规1Δ,nmt-tor2型和nmt-tor2全球技术法规1相反交配类型的Δ细胞在25°C的YES平板上生长2天。Tor2的过度表达挽救了在全球技术法规1Δ单元。(B类)双突变gfp-tor2 gtr1-rfp将含有硫胺（EMMT）的EMM细胞在30℃下培养，并转移到新鲜EMMT、添加氨基酸的EMMT和不含氮的EMMT中1小时。GFP–Tor2和Gtr1–RFP在液泡膜上共定位，无论培养基中是否存在氨基酸或氮。比例尺：10μm。(C类)mip1-myc，gtr1-flag和mip1-myc gtr1-flag公司细胞在EMM中生长，并在有或无氨基酸的情况下转移到EMM中1小时。如图所示，对细胞裂解物（输入）和Flag下拉组分进行SDS-PAGE，免疫印迹与抗Myc和抗Flag抗体孵育。Gtr1–Flag以氨基酸依赖的方式与Mip1–Myc（猛禽直系）发生物理相互作用。使用ImageJ软件通过密度计估计Gtr1–Flag和Mip1–Myc之间的相对相互作用，并将其标准化为在存在氨基酸的情况下降低的Mip1–Myc，设定为1。(天)野生型，全球技术法规1Δ和全球技术法规2Δ细胞在EMM中生长，并转移到含有或不含氨基酸的EMM中90分钟。细胞提取物经过SDS-PAGE和免疫印迹检测磷酸化Rps6（P-Rps6），作为TORC1活性的测量。磷酸化Rps6的相对量通过密度测定法进行估算，并归一化为微管蛋白表达。在存在氨基酸的情况下生长的野生型细胞中磷酸化Rps6的量设置为1。(电子)转速601Δmyc-rps602型细胞在有无氨基酸的条件下生长。用抗Myc抗体检测Myc–Rps6的含量。使用Rps6磷酸化（Rps602-P）作为TORC1活性的测量。Tubulin被用作负荷控制。
图5。
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vam6型Δ细胞显示细胞生长缺陷。(A类)野生型(重量)和vam6型Δ突变细胞在EMM、EMM+氨基酸和EMM+亮氨酸中呈指数增长。每2小时计数一次细胞数，以确定每种培养基中的加倍时间。野生型，vam6型Δ,全球技术法规1Q61L和vam6型Δ全球技术法规1Q61L细胞生长在EMMT（补充硫胺的EMM）板上(B类)并在补充有福洛辛B的平板上(C类)在硫胺素的存在下诱导低水平的全球技术法规1Q61L。vam6型Δ细胞形成含有大量死亡细胞的小菌落（B），产生深红色菌落（福禄考B阳性）（C）。的可行性vam6型表达Gtr1活性形式的Δ细胞(全球技术法规1Q61L)增加；这些细胞形成较大的集落（B和C），死亡细胞的数量减少（C）。(天)野生型，全球技术法规1Δ,gtr2型Δ,vam6型Δ,gtr1Q61升和vam6型Δ全球技术法规1Q61L细胞在30°C的EMMT（即硫胺素存在下）中生长，膜泡用FM6-64染色。vam6型Δ细胞膜融合缺陷；FM4-64无法染色vam6型Δ细胞，荧光呈小点状，与内胚小泡相对应。全球技术法规1Δ,全球技术法规2Δ或全球技术法规1Q61L细胞没有显示这种表型，FM4-64能够正确染色液泡膜。相同的缺陷vam6型膜融合中的Δ细胞在vam6型Δ全球技术法规1Q61L表明Gtr1的活性形式不能恢复vam6型Δ. (电子)野生型，vam6型Δ，全球技术法规1Q61L和vam6型Δ全球技术法规1Q61L细胞在30°C的EMMT中生长，并在有氨基酸和无氨基酸的情况下转移到EMMT中（在两种情况下都补充硫胺）。90分钟后收集细胞，并对提取物进行SDS-PAGE和免疫印迹检测Rps6磷酸化（P-Rps6），以测量TORC1活性。磷酸化Rps6的相对量通过密度测定法进行估算，并归一化为微管蛋白表达。磷酸化Rps6的量vam6型Δgtr1Q61升在氨基酸存在下生长的细胞被归一化为1。在存在氨基酸的情况下，野生型细胞中磷酸化Rps6的数量增加。这个vam6型突变体不能对氨基酸产生反应，TORC1的活性较低。相反，在表达全球技术法规1Q61L（Gtr1的活性形式）Rps6磷酸化增加。突变体vam6型当表达Gtr1Q61L时，显示出高Rps6磷酸化，表明Gtr1的组成活性形式能够在vam6型Δ单元。比例尺：1 cm（B）；1毫米（C）；10微米（D）。
图6。
图6。
Vam6和Gtr1在体内相互作用。(A类)gfp-vam6细胞在含有硫胺的EMM中在30°C下生长，液泡膜用FM4-64染色。GFP–Vam6定位于生长细胞的液泡膜。(B类)gfp-vam6 gtr1-rfp细胞在30°C的EMM中生长，并转移到EMM、补充氨基酸的EMM和不含氮的EMM（始终存在硫胺）。GFP–Vam6和Gtr1–RPF在所有条件下均与液泡膜共定位。(C类)gtr1-滞后，vam6-抽头和gtr1-滞后阀6-分接头细胞在EMM中生长并转移到补充有氨基酸的EMM中。20分钟和40分钟后收集细胞。如图所示，对细胞裂解物（输入）和TAP下拉部分进行SDS-PAGE，免疫印迹与抗TAP和抗Flag抗体孵育。使用ImageJ软件通过密度测定法估计Gtr1–Flag和Vam6–TAP之间的相互作用，并将氨基酸存在时拉下的Gtr1-Flag标准化为1。Gtr1–Flag以氨基酸依赖的方式与Vam6–TAP发生物理相互作用。比例尺：10μm。
图7。
图7。
显示Vam6、Gtr1–Gtr2和TORC1如何对氨基酸做出反应的假设模型。氨基酸通过Vam6和Rag蛋白激活Tor2，诱导翻译并促进细胞生长。在存在氨基酸的情况下，Gtr1与Gtr2强烈相互作用，这种异二聚体与Vam6结合。Vam6会激活Gtr1，而这反过来又会通过Mip1与TORC1复合体结合。活性TORC1复合物诱导Rps6磷酸化，从而诱导细胞生长并抑制性分化。这种激活将发生在液泡膜中，其中所有成分将以氨基酸依赖的方式强烈相互作用。
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