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。2012年3月23日；287(13):9817-9826.
doi:10.1074/jbc。M111.333534。 Epub 2012年2月3日。

MicroRNA-217通过下调SIRT1促进乙醇诱导的肝细胞脂肪堆积

户泉音 1, 胡明 1, 雷·张 1, 郑申 1, 劳拉·弗拉托 1, Min You（最小值） 2
附属公司

MicroRNA-217通过下调SIRT1促进乙醇诱导的肝细胞脂肪堆积

户泉音等。 生物化学杂志。 。

摘要

乙醇介导的肝sirtuin 1抑制（SIRT1）在酒精性脂肪肝的发病机制中起着至关重要的作用。在这里，我们通过鉴定乙醇作用的新肝脏靶点microRNA-217（miR-217）来研究这种抑制的潜在机制。研究了miR-217在培养的小鼠AML-12肝细胞和慢性乙醇喂养小鼠肝脏中对乙醇作用的调节作用。在AML-12肝细胞和小鼠肝脏中，慢性乙醇暴露显著且特异性地诱导miR-217水平，并导致过度脂肪堆积。进一步研究表明，AML-12细胞中miR-217的过度表达促进了乙醇介导的SIRT1和SIRT1调节基因的损伤，这些基因编码脂肪生成或脂肪酸氧化酶。更重要的是，miR-217会损害肝细胞中重要的脂质调节因子脂质-1的功能。综上所述，我们的新发现表明miR-217是肝脏中乙醇作用的特异性靶点，可能是治疗人类酒精性脂肪肝的潜在治疗靶点。

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数字

图1。
图1。
乙醇上调小鼠AML-12肝细胞中miR-217的表达。 A类用不同浓度的乙醇处理AML-12细胞24 h，并用qRT-PCR测定miRNA-217水平。B类用乙醇（50 m）处理AML-12细胞米)，4-甲基吡唑(400万像素)（0.1米米)或氰胺(青色)（0.1米米)24小时后，测定miR-217水平。所有数据均为平均值±标准偏差(误差线)至少3-5个实验。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图2。
图2。
miR-217促进乙醇暴露的AML-12肝细胞中TG的积累。用对照载体miR-217或Sc-miR217转染AML-12细胞。转染后48小时，乙醇（50 m米)已添加。孵育24小时后，通过尼罗红染色测量细胞TG含量(A类)和细胞酶试剂盒(B类). 所有数据均为平均值±标准偏差(误差线)至少3-5个实验。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图3。
图3。
miR-217在慢性乙醇喂养小鼠的肝脏中显著上调。喂食含或不含乙醇的对照饮食的小鼠肝脏中miRNA的相对水平。所有数据均为平均值±标准偏差(误差线)；n个=4-6只动物。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图4。
图4。
miR-217促进乙醇介导的AML-12肝细胞SIRT1抑制。 A类用SIRT1-3′-UTR报告子和表达质粒miR-217、Sc-miR-217和β-半乳糖苷酶（内部对照）转染AML-12细胞。乙醇（50 m米)转染后48小时，收集细胞，测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。B类用控制载体miR-217或Sc-miR-217质粒转染AML-12细胞。乙醇（50 m米)然后添加。qRT-PCR用于评估SIRT1的相对mRNA水平。所有数据均为平均值±标准偏差(误差线)至少3-5个实验。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图5。
图5。
miR-217促进乙醇介导的对AML-12肝细胞SIRT1蛋白和活性的抑制。 A类，AML-12细胞的细胞提取物，转染了含有或不含乙醇（50 m）的控制载体miR-217或Sc-miR-217的质粒米)用SIRT1、p-AMPKα、AMPKβ或β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。B类SIRT1的相对蛋白水平。C类，p-AMPKα/AMPKα比值的相对水平。D类用含有或不含有乙醇（50 m）的控制载体miR-217或Sc-miR-217质粒转染AML-12细胞，在AML-12中测定SIRT1脱乙酰酶活性米). SIRT1脱乙酰酶活性以任意荧光单位表示(非洲法郎). 所有数据均为平均值±标准偏差(误差线)至少3-5个实验。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图6。
图6。
miR-217调节AML-12细胞中编码脂肪生成酶或脂肪酸氧化酶的基因的表达。 A类用控制载体miR-217或Sc-miR-217质粒转染AML-12细胞。qRT-PCR用于评估乙酰辅酶A羧化物的相对mRNA水平(行政协调会)，硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1系列)和脂肪酸合成酶(船边交货).B类PGC-1α、PPARα和酰基辅酶A氧化酶的相对mRNA水平(AOX公司)转染miR-217和Sc-miR-217质粒的AML-12细胞。所有数据均为平均值±标准偏差(误差线)至少3-5个实验。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图7。
图7。
抑制miR-217可减轻乙醇介导的AML-12细胞SIRT1信号传导抑制。 A类用SIRT1-3′-UTR报告子和对照载体、抗miR-217和β-半乳糖苷酶（内部对照）的表达质粒转染AML-12细胞。乙醇（50 m米)转染后48h加入24h，收获细胞，测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。B类用对照载体miR-217或抗-miR-217转染AML-12细胞。转染后48小时，乙醇（50 m米)已添加。培养24小时后，用酶试剂盒测量细胞TG含量。C类用SIRT1、p-AMPKα、AMPKβ或β-actin抗体对转染对照载体或抗miR-217质粒的AML-12细胞的细胞提取物进行免疫印迹。D类，AML-12细胞转染对照载体或抗miR-217质粒。qRT-PCR用于评估乙酰辅酶A羧化酶的相对mRNA水平(行政协调会)，脂肪酸合成酶(船边交货)、PGC-1α和PPARα。所有数据均为平均值±标准偏差(误差线)至少3-5个实验。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图8。
图8。
miR-217损害AML-12肝细胞中的脂质-1信号。 A类、用对照载体miR-217、Sc-miR-217或SIRT1质粒转染的AML-12细胞中总脂质-1、脂质-1α、脂质-1β和SFRS10的相对mRNA水平。B类，相对L引脚1转染对照载体miR-217、Sc-miR-217或SIRT1质粒的AML-12细胞中的β/α比率水平。所有数据均为至少3-5次实验的平均值±标准偏差。意思是没有共同点信差异；第页<0.05。
图9。
图9。
miR-217阻断脂蛋白-1α核进入并损害脂蛋白-1核功能。 A类，HA-lipin-1的代表性显微照片(红色)或DAPI(蓝色)AML-12细胞的免疫荧光。用对照载体miR-217、Sc-miR-217，HA-lipin-1α或SIRT1转染AML-12细胞72 h，然后用或不用乙醇处理（50 m）米)18小时后，用抗HA（lipin-1）抗体对细胞进行免疫染色(红色)，细胞核用DAPI染色(蓝色). 原始放大倍数为×200。B类对近100个细胞的HA-lipin-1α分布模式进行评分，并将其分为两类：核优势分布(N个[百万吨]C类)和细胞质优势分布(N个<C类).C类，AML-12细胞转染UAS质粒三-TK荧光素酶和表达载体驱动Gal4-PGC-1α融合蛋白与对照载体miR-217或Sc-miR-217的表达，持续72小时。然后采集细胞，以检测荧光素酶活性。所有数据均为至少3-5次实验的平均值±标准偏差。没有共同字母的意思不同；第页<0.05。
图10。
图10。
miR-217在酒精性脂肪肝中的作用。
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