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.2012年3月；122(3):833-43.
doi:10.1172/JCI60256。 Epub 2012年2月6日。

细胞周期蛋白D1的ChIP测序揭示了在小鼠染色体不稳定性中的转录作用

马修·卡西米罗 1, 马克·克罗萨里奥尔, 埃马努埃莱·洛罗, 亚当·埃特尔, 左人于, 威廉·丹皮尔, 伊丽莎白·A·萨里亚, 亚历克斯·帕帕尼科劳, 蒂莫西·斯坦尼克, 李志平, 王晨光同学, 保罗·福蒂纳, 桑卡·阿迪亚, 艾丁·托泽伦, 埃里克·克努森, 安德鲁·阿诺德, 理查德·佩塞尔
附属公司

细胞周期蛋白D1的ChIP测序揭示了在小鼠染色体不稳定性中的转录作用

马修·卡西米罗等。 临床研究杂志. 2012年3月.

勘误表in

  • 临床投资杂志。2013年5月1日；123(5):2332

摘要

肿瘤中的染色体不稳定性（CIN）以染色体异常和基因表达特征改变为特征；然而，CIN的机制尚不清楚。CCND1（编码细胞周期蛋白D1）在人类恶性肿瘤中过度表达，并已被证明在转录调控中发挥直接作用。在这里，我们使用全基因组ChIP测序，发现细胞周期蛋白D1的DNA结合形式占据了控制染色体完整性和线粒体生物发生的基因的调控区域。将cyclin D1添加回Ccnd1（-/-）小鼠胚胎成纤维细胞中，可导致细胞周期蛋白D1的DNA结合形式占据CIN基因调控区，并诱导CIN基因表达。此外，通过光谱核型分析和免疫荧光，在cyclin D1再表达细胞中观察到染色体畸变增加、非整倍体和中心体异常。为了在体内评估细胞周期蛋白D1的作用，我们制作了具有急性和持续乳腺靶向细胞周期蛋白D_1表达的转基因小鼠。这些转基因小鼠表现出肿瘤发病率增加和标志性CIN基因图谱。此外，对2254例人类乳腺肿瘤的基因表达的研究表明，细胞周期蛋白D1的表达与管腔B型乳腺癌的CIN相关。这些数据表明，细胞周期蛋白D1通过直接调控调控染色体稳定性的转录程序，参与CIN和肿瘤发生。

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数字

图1
图1。细胞周期蛋白D1结合序列的鉴定。
(A类)2840个区间相对于相邻基因的分布。间隔被分为转录起始点（TSS）上游、基因内和TSS下游或基因下游。因为有些区间有1个以上的相关基因，有些区间有1个以上的术语。TSS上游被定义为–10000至0 bp。(B类)反FLAG中的峰值/CCND1号机组ChIP-Seq与IgG对照组比较。启动子区域内的峰值与转录起始点的10kb的峰值相似。ActRegs，活动区域。方框的边界表示SD；方框内的线表示平均值；晶须表示四分位范围；符号表示异常值。(C类)选择在与细胞周期蛋白D1相关的间隔区内富集的保守TF基序的例子。TF的完整列表见补充表2。
图2
图2。细胞周期蛋白D1与参与有丝分裂的基因相关。
(A类)DAVID基于顶级点击的富集分数百分比对细胞周期蛋白D1相关基因进行功能注释聚类。(B类)细胞周期蛋白D1结合的启动子区（0至–500 bp）在证明与CIN相关的基因中富集(P（P）< 0.0001). (C类)细胞周期蛋白D1结合区的代表性标记密度分布及其与转录起始位点的接近程度（箭头所示）。间隔的峰值用星号表示。(D类)基于细胞周期蛋白D1相关基因选择的靶mRNA的定量PCR。所示为的规范化表达比率抄送1–/–带有MSCV-FLAG的细胞/CCND1号机组与MSCV控制相比(n个=4个独立的细胞系；数据为平均值±SEM）。(E类)ChIP分析抄送1–/–MSCV-FLAG转导的3T3细胞/CCND1号机组使用抗FLAG抗体。根据峰值间隔序列设计引物。
图3
图3。Cyclin D1救援抄送1–/–MEF诱导多倍体和非整倍体。
(A类)细胞周期蛋白D1诱导基因（63）的表达谱因高CIN评分而丰富(P（P）< 0.0001). (B类)PI染色显示细胞周期蛋白D1多倍体增加-挽救组与对照组抄送1–/–MEF公司。(C类)基于3个独立细胞系的PI染色定量（平均值±SEM）*P（P）< 0.005. (D类,E类,H（H）、和我)来自天空控制和细胞周期蛋白D1的代表性中期-已获救抄送1–/–第6页的MEF(D类和E类)P23和3T3细胞(H（H）和我). 每个图都显示了中期的反向DAPI图像（右上角）、中期的原始光谱图像（左上角）和相同中期的分类（下角）。(F类和J型)中期染色体数目从对照组和细胞周期蛋白D1扩散到挽救组抄送1–/–第6页的MEF(F类)P23和3T3细胞(J型)显示了20次有丝分裂扩散的染色体总数。灰色阴影表示2N和4N（±2条染色体）与正常值的预期偏差。P（P）<0.001，抢救与控制，χ2关联测试。(G公司和K（K）)中期的相互易位和NRT从对照组和细胞周期蛋白D1中传播-挽救抄送1–/–第6页的MEF(G公司)P23和3T3细胞(K（K）)，显示为每个分析单元的事件数。平均分布用红色曲线表示。
图4
图4。细胞周期蛋白D1诱导中心体扩增和有丝分裂纺锤体紊乱。
(A类和C类)有丝分裂细胞的典型共焦最大Z投影(A类; α-微管蛋白（紫色）和DAPI（蓝色）的免疫染色以及前期、中期和中期(C类; 对照组和拯救的细胞周期蛋白D1的α-微管蛋白[紫色]、γ-微管素[黄色]和DAPI[蓝色和插图]免疫染色抄送1–/–细胞。原始放大倍数，×60 NA1.4油物镜，数字变焦放大×5。比例尺：5μm。(B类和D类)具有多个极性纺锤体的有丝分裂细胞的频率(B类)具有多个中心体（γ-微管蛋白）和纺锤体紊乱（α-微管素）的前中期/中期细胞(D类). *P（P）= 0.0289, χ2分析。黑条，中心体计数异常（即>2）；灰色条，正常计数（即2）。(E类和F类)中期控制和细胞周期蛋白D1最大Z投影的主轴测量抄送1–/–细胞。数据为平均值±SEM。插图显示了中期板（即染色质；Ch）宽度和长度（使用DAPI染色测量）以及纺锤体（Sp）宽度和长度（使用微管蛋白染色测量）*P（P）= 0.0486; **P（P）= 0.0087.
图5
图5。热图显示转基因小鼠模型中细胞周期蛋白D1差异调节的基因。
(A类)rtTA之间差异调节的基因/CCND1型肿瘤(n个=3）和来自rtTA对照小鼠的正常小鼠乳腺(n个=2），通过层次聚类可视化(B类)rtTA中CIN的差异调节基因（Fold>2，B>3）最多/CCND1号机组配置文件(P（P）< 0.0001). (C类)MMTV之间差异调节的基因-CCND1号机组–诱发肿瘤(n个=3）和正常小鼠乳腺(n个=2），通过层次聚类可视化(D类)MMTV中CIN的差异调节最大的基因（Fold>2，B>4）富集-CCND1号机组配置文件(P（P）< 0.0001).
图6
图6。乳腺癌微阵列样本的亚型分类。
(A类)热图描绘了来自5种乳腺癌基因表达亚型的联合乳腺癌微阵列数据集的样本。预测的ESR1、表皮生长因子受体（ERBB2）和孕酮受体（PGR）状态与CIN特征评分和CCND1号机组5种亚型的表达水平。概述了管腔B亚型受体状态、CIN特征评分和细胞周期蛋白D1表达水平。(B类)CCND1号机组转录水平与平均CIN标志性表达水平的对比显示，CIN评分高和cyclin D1表达高之间的关系是管腔B亚型特异性的（红圈）。(C类)Kaplan-Meier图显示了该数据集中无转移状态的差异(P（P）= 6.4462 × 10–8).
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