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.2012;7（1）：e30193。
doi:10.1371/journal.pone.0030193。 Epub 2012年1月23日。

尽管apoE小鼠体内的酶产生了相关的超氧物，但eNOS仍能保护动脉粥样硬化

帕德马普里亚·蓬努斯瓦米 1, 安吉丽卡·施罗德尔, 伊娃·奥斯特米尔, 萨宾·格吕纳, 保罗·L·黄, 乔治·埃特尔, 乌尔里希·霍夫曼, 伯恩哈德·尼斯瓦特, 彼得·库伦科特
附属公司

尽管apoE小鼠体内的酶产生了相关的超氧物，但eNOS仍能保护动脉粥样硬化

帕德马布里亚·蓬努斯瓦米等。 公共科学图书馆综合版. 2012.

摘要

背景：所有三种一氧化氮合酶（NOS）亚型均在动脉粥样硬化斑块中表达。NOS酶通常催化NO的生成。然而，在底物和辅因子缺乏的条件下，酶直接催化超氧化物的形成。考虑到这种替代化学，NOS对自发性高脂血症驱动的动脉粥样硬化关键事件的影响尚未被研究。在此，我们评估了内皮型一氧化氮合酶（eNOS）如何调节动脉粥样硬化中白细胞/内皮细胞-（L/E）和血小板/内皮细胞（P/E）的相互作用以及酶产生一氧化氮（NO）和超氧化物。

主要调查结果：颈动脉活体内显微镜（IVM）显示载脂蛋白E/eNOS双基因敲除小鼠（apoE（-/-）/eNOS（-/--））的L/E相互作用显著增加，而P/E相互作用与载脂蛋白E（-/-）相比没有差异。eNOS缺乏增加了颈动脉巨噬细胞浸润和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）在内皮细胞和平滑肌细胞中的表达。尽管斑块中其他NOS亚型（诱导型NOS、iNOS和神经元型NOS和nNOS）的表达，但NO的电子自旋共振（ESR）测量显示eNOS对总循环和血管壁NO的产生有显著贡献。eNOS的药理抑制和基因缺失降低了血管超氧化物的生成，表明载脂蛋白E（-/-）血管中的酶解偶联。

结论：明显的斑块形成、血管炎症增加和L/E-相互作用与载脂蛋白E（-/-）/eNOS（-/--）血管中超氧物生成的显著减少有关。因此，eNOS的缺乏不会导致氧化应激的自动增加。eNOS解偶联发生在载脂蛋白E（-/-）动脉粥样硬化中，但并不否定该酶的强大保护作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。通过活体显微镜分析L/E相互作用。
载脂蛋白E颈总动脉中滚动的、暂时粘附的和牢固粘附的白细胞数量显著增加−/−/电子NOS−/−（n=16），与apoE−/−对照组（n=23），a）*p<0.01；b） ***p<0.0001；c） **p<0.001）。
图2
图2。eNOS缺失增加了VCAM-1的表达。
a） 实时PCR分析显示，载脂蛋白E中VCAM-1 mRNA的表达增加了四倍−/−/电子NOS−/−（n=9）颈动脉，与apoE比较−/−（n=20，*p<0.01）。b） 免疫组织化学证实apoE颈动脉内皮细胞VCAM-1表达增加−/−/电子NOS−/−，与apoE相比−/−箭头表示DAB染色阳性（颈内动脉，IVM位置）。c） 动脉粥样硬化病变中VCAM-1蛋白的双重免疫荧光染色。载脂蛋白E主动脉弓切片−/−和apoE−/−/电子NOS−/−用抗VCAM-1抗体（红色）和抗CD31抗体（内皮细胞，绿色）孵育动物。箭头表示VCAM-1在覆盖层内皮细胞中的定位（黄色）。在apoE中观察到血管内皮细胞VCAM-1表达增加−/−/电子NOS−/−与apoE相比−/−d）在apoE的主动脉弓晚期斑块中观察到VCAM-1的内侧平滑肌细胞表达增加−/−/电子NOS−/−与apoE相比−/−VCAM-1（红色）和平滑肌细胞（绿色）的双重免疫荧光染色显示为黄色（箭头）。
图3
图3。eNOS中的NO影响血管壁中巨噬细胞的浸润。
a） CD14的实时PCR分析显示载脂蛋白E中CD14 mRNA的表达显著增加−/−/电子NOS−/−（n=12）颈动脉与载脂蛋白E比较−/−（n=17，*p<0.00002）。b） MOMA-2免疫组化显示apoE颈动脉血管巨噬细胞浸润增强−/−/电子NOS−/−（n=10），与apoE相比−/−（n=9，*p<0.05）。
图4
图4。eNOS缺乏时未改变的血管阻力指数。
a） 颈动脉双重超声检查的代表性图片。b） 载脂蛋白E颈动脉等阻力指数−/−，n=17，与apoE−/−/电子NOS−/−，n=10，p=0.88。NS表示无显著性。
图5
图5。eNOS是血管壁NO生成和循环NO的重要来源。
a） NO-Fe-（DETC）的ESR谱2载脂蛋白E的主动脉−/−和apoE−/−/电子NOS−/−粗体线表示apoE−/−，剥线apoE−/−/电子NOS−/−和图案线单独缓冲/自旋陷阱。箭头显示了NO-Fe-（DETC）的典型3个峰值2信号。b） C57BL/6J（n=12）、eNOS中的血管NO生成−/−（n=8），载脂蛋白E−/−（n=14）和apoE−/−/电子NOS−/−（n=15），*p≤0.01，**p<0.001，**p<0.0001）。c） 利用载脂蛋白E中的L-NAME抑制NOS生成血管NO−/−（n=11）和apoE−/−/电子NOS−/−小鼠（n=16），*p<0.01，***p<0.0001。d） 载脂蛋白E血样中的硝基血红蛋白浓度−/−/电子NOS−/−（n=11）vs.载脂蛋白E−/−对照组（n=13，*p=0.01）。
图6
图6。eNOS是解偶联的，有助于血管生成载脂蛋白E中的超氧化物−/−老鼠。
a） HPLC测量显示载脂蛋白E中的超氧物生成水平较低−/−/电子NOS−/−（n=13）vs.载脂蛋白E−/−（n=23）。apoE中的超氧化物水平较高−/−（n=23）与C57BL/6J（n=14）相比。有趣的是，载脂蛋白E中的超氧化物水平显著降低−/−/电子NOS−/−（n=13）与eNOS相比−/−（n=12）。b） L-NAME抑制载脂蛋白E中的超氧化物生成−/−（n=15）但不在C57BL/6J（n=17）和apoE中−/−/电子NOS−/−（n=12）主动脉。c） 使用L-NIO对eNOS的特异性抑制导致载脂蛋白E中超氧化物的产生显著降低−/−（n=19）。d） 使用ESR的总ROS生成显示apoE中的ROS水平显著增加−/−（n=23）与C57BL/6J（n=12）和apoE相比−/−/电子NOS−/−（n=15）。e） 同样，ESR测定的SOD抑制性超氧物生成也显示载脂蛋白e中超氧物水平显著增加−/−（n=23）与C57BL/6J（n=12）和apoE相比−/−/电子NOS−/−（n=15）。§p<0.05，*p<0.01，**p<0.001，***p<0.0001，NS表示无显著性。f） apoE中eNOS的解耦−/−eNOS蛋白二聚体/单体的western blot显示与C57BL/6J主动脉相比。
图7
图7。一氧化氮合酶亚型的血管表达。
载脂蛋白E主动脉iNOS蛋白表达显著增加−/−/电子NOS−/−（n=10）与apoE比较−/−小鼠（n=10）。nNOS的蛋白质水平在载脂蛋白E之间没有差异−/−（n=10）载脂蛋白E−/−/电子NOS−/−（n=11）。*p<0.05，NS表示无显著性。
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