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.2012年1月15日；30(2):165-73.
doi:10.1038/nbt.2107。

人类血管平滑肌亚型的产生提供了对胚胎起源相关疾病易感性的见解

克里斯汀·张 1, 安德烈亚·贝尔纳多, 马修·W·B·托特, 罗杰·佩德森, 桑杰·辛哈
附属公司

人类血管平滑肌亚型的产生提供了对胚胎起源相关疾病易感性的见解

克里斯汀·张等。 Nat生物技术. .

摘要

胚胎起源的异质性是血管平滑肌细胞（SMCs）的一个特征，可能会影响血管疾病的发展。人类多能干细胞（hPSCs）分化为发育起源特异性SMC亚型仍然很难实现。在这里，我们描述了一种化学定义的方案，其中hPSC最初被诱导形成神经外胚层、侧板中胚层或近轴中胚层。这些中间群体进一步分化为SMCs（>80%MYH11（+）和ACTA2（+）），其对血管收缩剂和体内血管周围区域的投资表现出收缩能力。衍生SMC亚型概括了以前使用不同来源的主动脉SMC进行的研究中记录的对细胞因子的独特增殖和分泌反应。值得注意的是，该系统预测来源于侧板中胚层的SMC会增加细胞外基质降解，这一点已通过相应来源的大鼠主动脉SMC得到证实。这种分化方法将在建模原始依赖性疾病易感性和开发用于再生医学的生物工程血管移植物方面有广泛的应用。

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数字

图1
图1
hPSCs中胚层亚型的诱导。(一)（i）使用FGF2、LY294002和BMP4（描述为FLyB）将HPSC最初分化为早期中胚层36小时。中胚层亚型规范要求另外3.5天的FGF2+LY294002（FLy）或FGF2+BMP4（FB）用于近轴或侧板诱导。（ii）BMP浓度沿原始条纹（PS）存在梯度。在命运图研究的基础上，中胚层亚型沿着胚柱上的梯度出现。(b条)韩国存托凭证和MEOX1（墨西哥）QRTPCR法检测人胚胎干细胞在FLyB中分化36小时后，在FGF2+LY294002中分别用Noggin（Nog）、BMP4（B）和/或Activin（A）分化3.5天后的表达水平。BMP4的浓度范围为0 ng/ml（B0）至100 ng/ml（B100）。(c（c）)通过QRTPCR测定，人胚胎干细胞侧板和近轴中胚层标记物表达水平在FLyB中分化36小时，然后在FGF2（F）或FGF2+BMP4（FB50，其中BMP4为50 ng/ml）中再分化3.5天，有（黑条）或无（白条）LY294002（Ly）。(d日)时间QRTPCR分析中胚层规范。在对FLyB进行常规36小时治疗后，分别使用FB50（红线）和FLy（蓝线）指定外侧和近轴中胚层。(e（电子）)KDR百分比+和TCF15+流式细胞仪检测第3天和第5天的细胞。(（f）)在第5天，对FB50和FLy处理的人群进行中胚层亚型特异性标记的免疫染色。比例尺，100μm。数据表示平均值±标准误差(n个= 3). 与第0天人群相比，显著差异用黑色表示，而两组之间的差异用红色表示(*P（P）< 0.05;+P（P）< 0.01; ^P（P）< 0.001).
图2
图2
有效地将中间谱系分化为血管平滑肌细胞。(一)概述了从hPSC中获得来源特异性SMC的条件的示意图。图1描述了FLyB+FB和FLyB+FLy分别生成侧板中胚层（LM）和近轴中胚层。用FGF2+SB431542（FSb）处理HPSC 7天，诱导神经外胚层（NE）分化。为了进一步分化为血管平滑肌细胞，每个中间群体再接受12天PDGF-BB+TGF-β1（PT）。SMC亚型，即神经外胚层衍生SMC、外侧中胚层衍生SM、近轴中胚层派生SMC分别缩写为NE-SMC、LM-SMC和PM-SMC。(b条)QRTPCR显示，在PT治疗的12天内，三个中间群体的SMC标记表达增加。数据表示平均值±标准误差(n个= 3). (c（c）)流式细胞术分析表明，SMC分化方案在三个hPSC株系中高效且可重复，结果中83-92%的人群MYH11和CNN1双重阳性。(d日)PT治疗12天后获得的对照hESCs与SMC亚型的微阵列基因表达热图。红色（上调）和蓝色（下调）表示所有样本的平均基因表达差异。(e（电子）)大多数SMC亚型的CNN1（红色）和TAGLN（绿色）免疫染色呈阳性。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为阴性对照，ASMC作为阳性对照。比例尺，100μm。(（f）)Western blot证实在hPSC衍生SMCs和ASMC中存在成熟SMC蛋白MYH11和SMTN，但在HUVEC中不存在。
图3
图3
hPSC衍生SMC的功能表征。(一)基于全球基因表达谱，维恩图表示SMC亚型与hESC（FDR 0.1%）相比差异上调的基因子集。利用DAVID生物信息学资源中的功能注释聚类分析了3604个常见上调基因。在前20个高浓缩组中，与血管平滑肌细胞相关的功能特征以黄色突出显示。(b条)（i）在加入收缩诱导剂卡巴胆碱后的10分钟内，通过流式细胞仪监测Fluo-4负载细胞的相对荧光单位（ΔRFU）的变化。（ii）衍生SMC和SMC对照中对卡巴胆碱反应的Fluo-4强度峰值ΔRFU(n个= 3). (c（c）)HPSC衍生SMCs和ASMC对卡巴胆碱治疗表现出收缩能力。除HeLa细胞外，所有SMC收缩细胞的表面积都有10-20%的变化(n个= 20). (d日)在皮下植入hPSC衍生SMCs和HUVECs（1:2）后2周采集Matrigel塞。然后用人特异性SMTN和PECAM1抗体对组织切片进行双重免疫染色。根据内皮管腔结构（绿色）的相对长度量化SMC投资，该结构在10个不同的光场中覆盖SMC（红色）。通过方差分析进行统计检验(*P（P）< 0.05). 比例尺，50μm。
图4
图4
MKL2敲除和细胞因子治疗验证了hPSC衍生SMC亚型的原始特异性特征。(一)60-65%击倒MKL2型通过QRTPCR验证MKL2 siRNA在中间群体（NE、LM和PM）中的表达水平。(b条)Western blot分析证实了与干扰siRNA对照相比，MKL2 siRNA敲除对蛋白质水平的影响。(c（c）)通过QRTPCR测定siRNA处理的中间群体SMC分化后SMC基因的表达水平。(d日)MYH11的百分比+/ACTA2公司+通过流式细胞术测定从siRNA处理的中间群体获得的SMC。(e（电子）)在使用所示细胞因子治疗的3天内，每24小时用MTT法监测SMC亚型的增殖反应。(（f）)细胞因子治疗24小时后SMC亚型的细胞周期分析。通过红峰（G0-G1）下、黄色阴影区（S）和蓝色峰（G2-M）下的面积（右侧图例）量化细胞周期不同阶段的细胞百分比。黑色虚线将G0-G1中生长停滞的细胞与对照组S和G2-M中的增殖细胞分开。(克)治疗10小时后，通过QRTPCR测定对照组和TGF-β1治疗的SMC的基因表达水平。(小时)Western blot分析证实TGF-β1处理的SMC亚型表现出明显的分泌反应。数据表示平均值±标准误差(n个= 3). 显示了与加扰siRNA或车辆控制相比的显著差异(*P（P）< 0.05;+P（P）< 0.01, ^P（P）< 0.001).
图5
图5
HPSC-derived SMC亚型预测相应起源的大鼠主动脉SMC中MMP和TIMP的表达和活性。(一)治疗6小时后，通过QRTPCR测定对照组（白色条）和IL-1β处理的SMCs（黑色条）中MMPs和TIMPs的基因表达水平。差分激活基质金属蛋白酶9和TIMP1公司在hPSC衍生SMCs（顶面板）和大鼠主动脉SMCs中均观察到表达。(b条)蛋白质印迹分析证实了独特来源的IL-1β处理的SMC中MMP9和TIMP1蛋白的差异量。(c（c）)在2.5天内，通过弹性蛋白酶和胶原酶测定评估SMC的蛋白分解能力。原始特异性SMCs（顶面板）复制了与大鼠主动脉SMCs对IL-1β的反应相似的弹性蛋白和胶原降解趋势。数据表示平均值±标准误差(n个= 3). 与车辆控制装置相比存在显著差异(*P（P）< 0.05;+P（P）< 0.01; ^P（P）< 0.001).
图6
图6
主动脉平滑肌细胞的不同胚胎起源可能与主动脉夹层的部位有关。主动脉平滑肌细胞起源于三种不同的发育谱系。主动脉根部源自次级心脏场，即侧板中胚层衍生物（蓝色实心箭头），而升主动脉和主动脉弓则源自神经嵴（红色实心箭头）。降主动脉平滑肌细胞起源于近轴/体节中胚层（绿色实心箭头）。在本研究中，我们的在体外hPSC衍生SMC亚型预测了相应来源的主动脉SMC对炎症介质IL-1β的不同MMP和TIMP激活（虚线箭头）。我们认为，原始特异性SMCs在疾病环境中表现出不同的蛋白水解能力，这可能导致主动脉壁不同区域结构完整性的不同丢失。机械性能的这种差异可能会使主动脉夹层的部位优先发生在不同SMC谱系之间的边界（由黑色锯齿螺栓表示）。
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