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.2012年3月7日；31(5):1203-16.
doi:10.1038/emboj.2011.482。 Epub 2012年1月10日。

CaMKII绑定到GluN2B在内存整合期间至关重要

Amy R停下 1, 罗伯特·F·达尔拉皮亚扎, 于舟, 伊瓦尔·S·斯坦, 海茜, 斯科特·朱蒂, 索尼娅·沃伊西克, 尼尔斯博泽, 阿尔西诺·J·席尔瓦, 约翰内斯·沃尔
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CaMKII绑定到GluN2B在内存整合期间至关重要

Amy R停下等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

记忆对我们的日常生活和自我意识至关重要。通过NMDA型谷氨酸受体（NMDAR）的Ca（2+）内流以及随后的Ca（2+）和钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKII）的激活是记忆形成及其生理相关性长期增强（LTP）所必需的。Ca（2+）内流诱导CaMKII与NMDAR结合，战略性地将CaMKIl招募到正在增强的突触。我们产生了具有两个点突变的小鼠，这些点突变损害了CaMKII与NMDAR GluN2B亚单位的结合。Ca（2+）触发的突触后积累在很大程度上被CaMKII消除，而TARP则不稳定，而TARPs锚定AMPA-型谷氨酸受体（AMPAR）。LTP降低50%，CaMKII使AMPAR GluA1亚单位磷酸化，从而增强AMPAR电导。突变小鼠学习莫里斯水迷宫（MWM）和WT，但在早期记忆巩固期间表现出回忆不足。因此，CaMKII与NMDAR之间的活动驱动交互对于训练后24小时（而非1-2小时）的MWM记忆回忆非常重要，这可能是由于巩固受损所致。

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图1
图1
GluN2B KI小鼠中活性受损诱导的CaMKII与NMDAR结合。(A类)GluN2B LR/AQ突变减少NMDAR复合物与CaMKII的关联。用1%脱氧胆酸提取WT、杂合子（Het）和纯合子GluN2B KI（KI）小鼠前脑的膜组分，然后通过超速离心、用CaMKIIα抗体或同型匹配的对照IgG（“Mix”；每个基因型占该对照IP提取物的33%）去除不溶物以及NMDAR亚单位和CaMKIIα的IB（Leonard等人，1999年）。(B类)对免疫信号进行量化，并将NMDAR信号除以CaMKIIα信号，并将其标准化为相应NMDAR亚单位的WT值。WT值归一化为所有实验的平均WT值。条形图表示每个基因型在指定实验次数下的平均值±标准误差(n个). 星号(*)表示P（P）与WT相比<0.05（单向方差分析）。(C类)GluN2B LR/AQ突变不会减少NMDAR复合物与PSD-95的关联。在离心前用1%脱氧胆酸提取GluN2B WT和纯合GluN2B-KI小鼠前脑的膜组分，然后用GluN2B抗体或兔对照IgG进行IP（“混合”；每个基因型为该对照贡献50%的提取物），并用IB提取NMDAR亚基和PSD-95。(D类)免疫信号被量化，PSD-95信号被GluN2B信号分割，并归一化为相应NMDAR亚单位的WT值。将WT值归一化为所有实验中的平均WT值。数据表示三个实验的平均值±标准偏差。统计分析显示co-IP基因型之间没有差异(P（P）>0.05;t吨-测试）。(E类)活动驱动的CaMKII绑定到NMDAR需要与GluN2B交互。前脑切片在提取前立即用载体或NMDA处理（200μM，5分钟；加上1μM TTX以防止过度兴奋），CaMKIIαIP和IB用于GluN2B、GluN1和CaMKILα，如前所述（Leonard等人，1999）。50%WT和50%KI裂解物（混合物）与对照IgG的混合物的模拟IP显示CaMKIIαIP的特异性。(F类)NMDA诱导的NMDAR与CaMKII相关性增加在WT和GluN2B KI之间存在显著差异(t吨-测试：*P（P）<0.05;n个=4). (G公司)GluN2B KI小鼠的CaMKI刺激不受影响。急性皮质切片在IP前用载体或NMDA加TTX治疗，抗CaMKIIα和IB检测磷酸化Thr286（pT286）和总CaMKIL。(H（H）)免疫信号被量化，pT286信号被CaMKIIα信号分割，并归一化为WT值。数据表示三个实验的平均值±标准偏差。统计分析显示co-IP基因型之间没有差异(P（P）>0.05;t吨-测试）。
图2
图2
GluN2B KI神经元中活动驱动的突触后CaMKII积累的丢失。(A类–P（P）)总之，20只来自WT和KI小鼠的DIV海马培养物用载体（水；A–F，M1–N3）或谷氨酸（100μM，5分钟；G–L，O1–P3）处理，立即固定（4%多聚甲醛，30分钟），并染色CaMKIIα（绿色覆盖物）和突触素（红色覆盖物）。C、F、I和L中概述的区域以更大的放大倍数显示(M（M）–P（P）)分别为。的比例尺(A类–L（左）)英寸(A类)为25μm，适用于(M（M）–P（P）)在M1中为5μm。(问,R（右）)Pearson系数表明，谷氨酸处理显著增加了WT培养物中CaMKII与突触蛋白的共定位，但没有增加KI培养物的共定位(问)以及与阈值化后测定的突触蛋白簇共定位的CaMKII簇分数的量化(R（右）; 双向方差分析，P（P）<0.05;n个=3，每个实验和条件分析10个神经元；*P（P）<0.05; 误差条：s.e.m.）。
图3
图3
成年GluN2B KI小鼠的基底突触传递正常。(A类)fEPSP对急性海马脑片CA1区20–500 ms刺激间隔的成对脉冲促进作用对WT和KI小鼠几乎是相同的，表明兴奋-胞吐耦合没有改变。(B类)WT和KI小鼠在10Hz频率下对重复刺激的反应中fEPSP的减少是相当的，这表明突触小泡的完全可释放池没有变化。(C类)在频率为100 Hz的重复刺激下，WT和KI小鼠fEPSP的减少与之相当，这表明容易释放的突触小泡池没有改变。(D类)在200 nM TTX存在下，通过CA1锥体细胞的全细胞斑贴记录监测AMPAR介导的mEPSCs，以阻断Na+从而阻止自发动作电位，10μM荷包牡丹碱阻断GABAA类受体和50μM AP-5阻断NMDAR。WT和KI小鼠神经元中mEPSCs的振幅（中间）和频率（右侧）在统计学上没有差异。条形图左侧显示了WT和KI小鼠的代表性痕迹。(E类,F类)反映AMPAR响应强度的标准条件下初始fEPSP斜率的平均值（±s.e.m.）(E类)或含有8μM CNQX（阻止AMPAR）且不含Mg的ACSF2+表示NMDAR响应强度(F类)绘制了与随刺激强度增加而获得的突触前纤维抽射振幅（作为突触前激活水平的测量）的关系图。每个面板右侧的插页显示了WT（顶部）和KI（底部）刺激强度增加的样本轨迹。每个面板显示的数据（±s.e.m.）来自n个每个基因型从3到5只小鼠中获得的切片。
图4
图4
成年GluN2B KI小鼠的LTP降低。(A类)急性海马脑片CA1的LTP（2×100 Hz/1 s）稳定在基线的156±6%（WT）和121±4%（KI）（平均值±s.e.m.），显示WT和KI小鼠脑片之间存在显著差异(t吨-测试：P（P）<0.05). 插入物显示了WT（顶部）和KI（底部）小鼠诱导LTP（红色）前（黑色）和60分钟后的fEPSP样本痕迹。(B类)两种基因型的LTP均被100μM AP5阻断。LTP诱导60分钟后，WT和KI切片的记录分别稳定在107±6%和104±4%。(C类)两种基因型中的LTP均被10μM KN93阻断。WT和KI切片的记录分别稳定在108±8%和108±5%。(D类)θ突发刺激（10列4个刺激，100 Hz；序列间隔200 ms）在CA1中诱导的LTP表现出显著差异(t吨-测试：P（P）<0.05）。(E类)10 Hz/15 s刺激诱导的LTP显示，WT小鼠切片中fEPSP增加38±2%，KI小鼠切片增加17±2%(t吨-测试：P（P）<0.05). (F类)LTD（1 Hz/15分钟）稳定在基线（±s.e.m.）的76±5%（WT）和72±6%（KI），显示WT和KI小鼠的切片之间没有差异(t吨-测试：P（P）>0.05). 插入物显示了WT（顶部）和KI（底部）小鼠诱导LTD（红色）前（黑色）和60分钟后的fEPSP样本痕迹。每个面板都显示来自n个每个基因型从3到5只小鼠中获得的切片。
图5
图5
CaMKII刺激GluA1 S831磷酸化的缺陷。(A类)在用1%Triton X-100提取AMPAR、超速离心去除非溶解物质、GluA1 IP和GluA1 pS831和总GluA1的顺序IB之前，在GF109203X（10μM）存在下处理前脑切片，用载体或NMDA（100μM，5分钟）抑制PKC（Leonard等人，1999）。WT和KI裂解物混合物（混合物）与对照IgG的模拟IP显示GluA1 IP的特异性。(B类)NMDA显著增加了WT切片中的S831磷酸化，但KI切片中没有（所示为平均值±s.e.m.；双向方差分析，*P（P）<0.01;n个=3).
图6
图6
GluN2B KI小鼠化学LTP后突触后CaMKIIαT286磷酸化维持和TARP积累不足。(A类)前脑切片接受对照（Ctl）或cLTP治疗（cLTP）；用福斯克林连续孵育，然后增加K+在没有镁的情况下2+（Lu等人，2007），如有指示，随后在ACSF中恢复30分钟（30′）。通过差速离心分离P2组分，用0.5%Triton X-100和超速离心收集的粗PSD组分去除突触前和突触周元件。IB在PSD组分中检测到PSD-95、CaMKIIαpT286、CaMJIIα和CaMKIIIβ(B类)经cLTP治疗后，WT和KI切片的PSD分数中CaMKIαpT286与总CaMKIIα的比值（归一化为WT对照，表示为平均值±s.e.m.）增加，但这种增加仅在WT分数中持续，而在KI分数中不持续（双向方差分析，**P（P）<0.01;n个=3). (C类)通过将总CaMKIIα信号归一化为PSD-95信号（表示为平均值±s.e.m.）获得的PSD分数中的相对CaMKIα丰度在cLTP处理后在WT切片中增加，但在KI切片中没有增加（双向方差分析，*P（P）<0.05;n个=3). (D类)通过差速离心和蔗糖梯度离心、用0.5%Triton X-100提取PSD和最终蔗糖梯度离心，从WT和KI前脑中高度纯化PSD。粗裂解物（Lys）、P2组分（P2）、突触体富集组分（Syn）和高PSD富集组分对CaMKIIαpT286和CaMKIIIα进行顺序IB。(E类)与WT相比，KI小鼠高纯度PSD中CaMKII T286相对于总CaMKI的磷酸化显著降低（平均值±s.e.m。；t吨-测试：*P（P）<0.05;n个=3). (F类)对急性皮层切片进行处理，分离出PSD粗提物，如(A类)PSD-95和TARP的IB之前（stg/γ2、γ3、γ4、γ8）。(G公司)cLTP处理后，WT和KI切片的粗PSD组分中TARPγ-8（55 kDa）的累积量增加，但与WT相比，KI组分中的TARPγ-8的累积量没有持续存在（平均值±s.e.m.；双向方差分析：*P（P）<0.05;n个=3).
图7
图7
GluN2B KI小鼠的旷野行为和RotaRod平衡正常。(A类)根据单个小鼠在20分钟内1分钟内的平均移动距离计算出的旷野平均移动距离。(B类)根据单个小鼠在20分钟内1分钟内“Z”阵列中光束断裂（即饲养或跳跃）的平均次数计算的开阔地平均垂直活动。(C类)根据单个小鼠在20分钟内1分钟内离开光电池阵列（跳跃）的平均次数计算的开放场平均跳跃次数。(D类)在各个区域内移动的平均距离（开阔场地分为九个大小相等的方形；区域1-4：四个角中每个角中的单个方形；区域0：剩余区域由五个方形组成，即中心方形加上靠近中心方形四个边的四个边方形）。(E类)中心（0区）内移动的平均步行距离与总步行距离的比率。(F类)TMT诱导的冷冻在将小鼠放入试验箱的前4分钟内逐渐增加，WT和KI小鼠的冷冻程度相同（Dallapiazza和Hell，数据未说明）。如图所示，在6分钟的观察期内，KI和WT小鼠的整体冷冻没有差异。(G公司)RotaRod的平均下降延迟是根据3天内单个小鼠每天三次试验的平均延迟计算得出的。所有数据均为平均值±标准误差n个=每个基因型9只小鼠。上述参数均未显示任何统计显著差异(t吨-测试）。
图8
图8
GluN2B KI小鼠MWM的巩固而非学习受损。(A类)KI小鼠在24次练习跑（12个训练块，每个训练块包括2次跑）中学会了逃往隐蔽平台，逃往程度和速度与同窝的WT小鼠相同。(B类,C类)在第3天的培训课程后1小时的探针测试期间(B类)第5天(C类)，KI小鼠像WT一样选择性地搜索目标象限（TQ）(D类)在第9天的探针测试中，KI小鼠的TG时间明显少于WT小鼠（F1,16=8.55,*P（P）<0.01). (E类–H（H）)第三天训练1小时后，第二组KI小鼠在探针试验中表现正常(E类)和第5天(F类)但在第7天的探针测试中，与WT小鼠相比，在TQ中搜索时间更少(G公司; F类1, 13=6.87,*P（P）<0.05). TQ交叉口数量(H（H）)KI小鼠与TQ的接近度也降低（KI:37.3±1.7 cm；WT:30.5±1.8 cm；F1,13=6.18,*P（P）<0.05). (我)GluN2B KI小鼠学习桡臂迷宫任务的时间进程和程度与同窝WT小鼠相同。所示为B阶段进入武器的正确条目占A阶段连续10天关闭的条目总数的百分比。(J型)达到学习标准后，将间期间隔随机增加到15、30、60或120分钟，以测试短期空间记忆。同样，在不同的时间间隔内，各组之间没有显著差异(t吨-测试：*P（P）>0.05，间隔时间为2、15、30、60和120分钟）。所有数据均显示为平均值±标准误差。
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