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.2012年4月；31(3):187-96.
doi:10.1016/j.matbio.2011.12.003。 Epub 2011年12月30日。

VI型胶原α5和α6链在人类肌肉和Duchenne肌营养不良相关肌肉纤维化中的表达

帕特里齐亚·萨巴泰利 1, 弗朗西丝卡·瓜兰迪, 苏迪尔·库马尔·加拉, 保罗·格鲁马蒂, 亚历山德拉·赞帕雷利, 埃琳娜·马托尼, 卡米拉·佩莱格里尼, 卢西亚诺·梅里尼, 亚历山德拉·费里尼, 保罗·博纳尔多, 纳迪尔·马里奥·马拉尔迪, Mats Paulsson公司, 斯特凡诺·斯夸佐尼, 雷蒙德·瓦格纳
附属机构

VI型胶原α5和α6链在人类肌肉和Duchenne肌营养不良相关肌肉纤维化中的表达

帕特里齐亚·萨巴泰利等人。 基质生物. 2012年4月.

摘要

胶原蛋白VI是一种主要的细胞外基质（ECM）蛋白，在维持骨骼肌功能完整性方面发挥着关键作用。COL6A1、COL6A2和COL6A3基因突变会导致Ullrich先天性肌营养不良（UCMD）、Bethlem肌病和肌硬化症。此外，Col6a1（-/-）小鼠和VI型胶原缺乏斑马鱼表现出肌病表型。最近，在人类中发现了另外两条胶原蛋白VI链，即α5和α6链，但它们在人类骨骼肌中的分布模式和功能尚未得到彻底研究。通过免疫荧光分析，在肌内膜和肌周膜中检测到α6链，而α5链标记仅限于肌腱连接处。在正常肌肉培养中，ECM中存在微量α6链，而未检测到α5链。在缺乏抗坏血酸的情况下，α6链主要积聚在结蛋白阴性细胞亚群的细胞质中，很可能是间质来源的，因为它们表达α-平滑肌肌动蛋白，因此可以被视为肌成纤维细胞。TGF-β1治疗是一种诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化分化的促纤维化因子，在添加抗坏血酸后，增加了细胞外基质中α6链的沉积。为了确定α6链在肌肉纤维化中的作用，我们研究了杜氏肌营养不良（DMD）患者的活检。我们发现，α6链在纤维化区域显著上调，而在纤维化区域，α5链则无法检测到。我们的结果表明，与广泛分布的同源α3链相比，新的α6和α5链在骨骼肌中的分布有限且存在差异，这表明这些新链可能在特殊ECM结构中发挥特殊作用。虽然α5链可能在承受拉伸应力的组织区域具有特殊功能，但α6链似乎与肌肉纤维化期间的ECM重塑有关。

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数字

补充图1
补充图1
UCMD患者胫骨前肌层粘连蛋白γ1链（左图）、胶原VIα1α2α3链（中图）和胶原VIα6链（右图）的免疫荧光分析COL6A1系列该基因显示肌肉和毛细血管中完全没有VI型胶原链，相反显示正常的层粘连蛋白γ1标记。棒材，20μm。
补充图2
补充图2
肌源性分化7天后，对正常肌肉培养物中的VIα3胶原（左面板，红色）和α6链（右面板，红色。结蛋白抗体（绿色）双重标记显示有效的肌源性分化，如多核肌管的存在所示。α3链（红色，左上下面板）存在于肌管周围的细胞外基质和结蛋白阴性细胞的细胞质内。分化肌管内部（左下面板）未检测到红色标记。在细胞外基质中可以微弱地检测到α6链。一些结蛋白阴性细胞显示出细胞质标记（箭头，右下图），而肌管内没有蛋白质。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。
补充图3
补充图3
a： 对DMD1179和DMD1112患者的肌肉切片进行免疫荧光分析，结果显示，两次营养不良活检的肌内膜中都有显著的α6链沉积。棒材20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。b： 正常对照CTRL2、DMD1112、DMD1179和DMD815患者肌肉切片中III型胶原的免疫荧光分析。与对照组CTRL2相比，表明结缔组织增生的III型胶原在所有DMD患者的肌内膜和肌周出现增加。棒材20μm。c： VI型胶原α6链和III型胶原阳性区域的半定量分析的图形表示，表明DMD患者III型胶原的增加与α6链蛋白量之间存在强烈的相关性*P＜0.05。
图1
图1
正常人胫骨前横肌段VIα6和α3胶原链的免疫荧光分析。a： α6链在肌周和肌内膜中均有表达，肌纤维周围有不连续的模式。α3链免疫标记在肌周和肌内均呈弥漫性和均匀性。棒材，100μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。b： α6链标记在肌内膜中不连续（箭头所示），双重标记显示与抗α3链部分共定位。α3链抗体强烈染色基底膜，如层粘连蛋白γ1链的双重标记所示（合并图像中的黄色荧光）；α6链在相邻纤维间质中表达，在毛细血管和肌纤维的基底膜中缺失。与间隙定位一致，α6链与III型胶原共定位。Bar，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。
图2
图2
人体肌肉中VIα6胶原的免疫荧光分析。a： 胶原VIα5链在胫骨前横截面（交界外，左侧面板）和比目鱼肌插入Achille肌腱处的横截面（MTJ，中间和右侧面板）中的定位。α5链（绿色）在胫骨前间质中不存在，而在比目鱼肌的肌腱连接处选择性表达（箭头），在那里它与层粘连蛋白α2链（红色）共同定位，层粘连蛋白α2链是基底膜的标志物。条形图，左面板和中面板为100μm，右上面板和下面板为20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。b条：用抗α5链（绿色）和抗pFAK（红色）抗体对插入跟腱的比目鱼肌部分进行双重标记，显示α5链在肌腱连接的细胞外侧表达，其中pFAK标记集中。合并后的图像显示了两种标记模式的清晰对应。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。
图3
图3
正常肌肉培养中VI型胶原α3和α6链的免疫荧光分析。a： 在增殖和长期（抗坏血酸处理汇合后7天）样品的细胞外基质中均检测到VIα3胶原链（红色荧光），但在长期培养中，VI胶原网络的排列似乎更有条理。棒材，100μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。b： 抗坏血酸处理7天后，在肌肉培养物的细胞外基质中可检测到胶原VIα6链（红色荧光）沉积。包含α6的结构（箭头，左上面板）显示出丝状排列，如在高倍镜下检测到的那样（右上面板）。下部面板显示抗α6（红色荧光）和α3（绿色荧光）链抗体的双重标记。丝状α6链状结构（红色）与α3链状阳性微丝共存，如合并图像所示（右下图），但也可以检测到独立的α3链式网络（绿色荧光）。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。c： COL6A3和COL6A6转录物的实时PCR分析。报告值是使用ACTB和GAPDH作为参考转录物的两个不同实验的平均值。以下各项的相对比率COL6A3系列/肌动蛋白-GAPDH和COL6A6系列/增殖细胞中的肌动蛋白GAPDH mRNA被标准化为1。长期细胞中COL6A3和COL6A6转录水平均增加（COL6A2为1.7:1，COL6A1为2.9:1）。d： 在无抗坏血酸处理的长期正常肌肉细胞培养中对VIα3和α6胶原链的免疫荧光分析。对样品进行连蛋白（上图，绿色荧光）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA；下图，绿色荧光）的双重标记。胶原VIα3链（红色荧光，左上图）似乎在结蛋白阳性细胞中缺失，在结蛋白阴性细胞中积聚，表明成纤维细胞是α3链的主要来源。类似地，结蛋白阳性细胞中不存在α6链（红色，右侧，上面板），但与α3链不同，它仅在细胞内结蛋白阴性细胞的子集中检测到。细胞产生的VI型胶原α6链（红色）对α-平滑肌肌动蛋白呈阳性反应（绿色，右下方），表明它们可能是肌成纤维细胞。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。
图4
图4
TGFβ1治疗后正常肌肉培养中α6链的免疫荧光和实时PCR分析。a： TGFβ1治疗10天后，大多数间质细胞表达α-SMA（左上角，绿色荧光），表明转分化为肌纤维母细胞样表型。在缺乏抗坏血酸的情况下（右上图），大多数表达α-SMA的细胞在细胞内积累了VI型胶原α6链（红色）。抗坏血酸处理后（左、右中面板），细胞外基质中大量分泌α6链（红色）并排列成宽丝状网络。TGFβ1处理样品10天后，左、右下面板显示抗α6和α3链抗体的双重标记。α6链（红色荧光）主要与α3链（绿色）标记共定位。然而，还可以检测到独特的含α3−的网络（绿色荧光）。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。b条：实时PCR分析。报告值是使用ACTB和GAPDH作为参考转录本的两个不同实验的平均值COL6A3系列/肌动蛋白-GAPDH和COL6A6系列/未经处理的细胞中的肌动蛋白GAPDH mRNA归一化为1。长期（10天）TGFβ1治疗后，细胞内COL6A3和COL6A6转录水平显著降低（COL6O3为0.48:1，COL6A2为0.16:1）。不同时间点的mRNA水平分析显示，从治疗24小时开始，COL6A6 mRNA的转录水平一直较低。相反，COL6A3 mRNA在24-48小时开始轻微上调，随后在延长TGFβ1治疗后逐渐降低。
图5
图5
DMD患者肌肉活检中α6链的免疫荧光分析。a： 对三名Duchenne肌营养不良患者（DMD815、DMD1、DMD23）肌肉切片中的VIα6胶原链（红色）和层粘连蛋白γ1链（绿色）进行免疫荧光分析。α6链标记在肌内膜和肌周出现增加，其增加与纤维化程度相关。α6链定位严格为间质定位，与层粘连蛋白γ1链（右图，绿色荧光）（基底层的标记）没有共同定位就证明了这一点。棒材，100μm。b： DMD815肌肉切片中VIα3胶原链的免疫荧光分析显示纤维化区域显著增加（红色荧光，左图）。用抗层粘连蛋白γ1链抗体双重标记（绿色），显示肌纤维基底层存在α3链（合并图像中的黄色荧光，右图）。c： 高倍放大患者DMD815的肌肉切片，用抗胶原VIα6（红色荧光）和-α3（绿色荧光）链的抗体双重标记，显示存在包含α6和α3链的不同大小的波动/波浪状纤维束。在肌纤维的基膜中，只发现α3链（箭头所示）。棒材，20μm。细胞核用DAPI（蓝色）复染。
图6
图6
DMD患者肌肉活检中VI型胶原链的Western blot和RT-PCR分析。a： 健康对照组（CTRL1,2）和DMD815、DMD1112和DMD1179患者骨骼肌提取物的Western blot分析。在还原条件下用SDS-PAGE分离蛋白质，并用针对VI型胶原α6、α3和α1链的多克隆抗体检测蛋白质；肌动蛋白作为负载对照。b： DMD骨骼肌活检中COL6A6转录物的实时PCR分析。报告值是使用ACTB和GAPDH作为参考转录物的两个不同实验的平均值。以下各项的相对比率COL6A3系列/肌动蛋白-GAPDH和COL6A6系列/对照肌肉中的肌动蛋白GAPDH mRNA被标准化为1。DMD肌肉中胶原VIα3和α6链数量的增加与相应mRNA的增加相匹配。在三个分析样本中，COL6A6转录水平显示出10到14倍的变化，而COL6A3 mRNA水平的变化较低（2到4倍的变化）。
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