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.2012年1月17日；109(3):823-8.
doi:10.1073/pnas.1118744109。 Epub 2012年1月4日。

Cullin-3调节晚期内体成熟

雅塔·霍塔里 1, 纳撒利·迈耶·沙勒, 米凯拉·胡布纳, 莎拉·斯陶弗, 纳迪娅·凯萨德, 彼得·霍瓦思, 罗伯塔·曼奇尼, 阿里·海伦纽斯, 马提亚斯·彼得
附属公司

Cullin-3调节晚期内体成熟

雅塔·霍塔里等。 美国国家科学院程序. .

摘要

Cullin-3（Cul3）在Bric-a-brac、Tramtrack、Broad-complex（BTB）-Cul3-Rbx1泛素E3连接酶复合物中起支架蛋白的作用。在此，我们报告了之前未描述的Cul3复合物在晚期内体成熟中的作用。RNAi介导的Cul3缺失导致两种内溶酶体途径的运输缺陷，即a型流感病毒（IAV）和表皮生长因子受体（EGFR）。IAV能够到达酸性内体区室，与LE/溶酶体（LY）标记物一致。然而，它仍然被困住，或者衣壳在渗入细胞溶质后无法揭开。同样，EGFR的激活和随后的泛素化似乎正常，而下游EGFR降解延迟，其配体EGF在LE/LYs中积累。事实上，Cul3缺失细胞在LEs中表现出严重的形态缺陷，这可能是这些贩运缺陷的原因；它们积累酸性LE/LY，并且一些细胞变得高度液泡化，具有增大的Rab7阳性内体。总之，这些结果表明Cul3在调节溶酶体内贩运途径的后期步骤中起着关键作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Cul3的耗尽可将IAV输送至酸化的隔间，但会阻止IAV脱膜。(A类)通过IAV NP和VSV-G蛋白产量测定A549细胞中的病毒感染。所示为平均感染，通过三个独立实验的SEM标准化控制siRNA。(B)A549细胞敲除效率验证。(C)感染后2 h（p.i.）IAV HA酸化，用A1抗体染色测定。用DNA染料DRAQ5对细胞核进行染色。量化显示每个细胞的A1阳性区域，归一化为siControl。(D类)IAV脱包衣试验，抗M1染色，3 h p.i.定量显示基于M1扩散表型的细胞分类，分类为未包衣，并归一化为siControl。(E类)IAV NP的核导入分析，5 h p.i.定量显示NP阳性核的百分比，归一化为siControl。对于C–E类图中显示了细胞中点的单个共焦截面。所有图形的横线表示至少三个独立实验的平均值±SEM。针对V-ATPase亚单位（ATP6V1B2）的siRNAs被用作所有三种检测的阴性对照。（比例尺：10μm）
图2。
图2。
IAV在Cul3缺失细胞LAMP1阳性LE/LYs中被阻断。(A类和B)用内体标记物对IAV进行染色。转染siRNA的A549细胞感染1(A类)或3(B)h用IAV，A1染色(A类)或M1（红色）(B)以及EEA1、CI-M6PR或LAMP1（绿色）抗体。所示为单共焦截面。（比例尺：2μm）共定位量化显示了至少三个独立实验中A1或M1阳性病毒颗粒与内吞标记物EEA1、CI-M6PR或LAMP1共定位的平均分数。(C)胞吞旁路试验。所示为相应类型实验的平均感染率；酸旁路（填充棒）或正常感染（开放棒），使用三个独立实验的SEM标准化为siControl。
图3。
图3。
标记的EGF和EGFR在Cul3缺失细胞中积累。(A类)EGF随着时间的推移在细胞内积累。将siRNA转染的HeLa细胞饥饿过夜，并用100ng/mL EGF TxRed处理5分钟（脉冲），然后替换为完全培养基（追逐）。图像和上的分钟数x个图轴表示添加EGF-TxRed的总时间（5分钟脉冲加追逐）。量化显示每个细胞的平均EGF-TxRed信号，用至少三个独立实验的SEM标准化为siControl 5分钟。（比例尺：10μm）转染HeLa细胞EGFR的免疫印迹(B)siRNAs（Cul3斑点标记中的星形标记为Cul3的neddylated形式）或(C)HA-Cul3或HA-对照质粒。
图4。
图4。
EGFR溶酶体降解延迟，而磷酸化和泛素化发生在Cul3缺失时。(A类)来自siRNA转染HeLa细胞的EGFR mRNA水平，通过定量RT-PCR定量，与来自至少三个独立实验的相应SEM的siControl相比，归一化为GAPDH。(B)EGFR降解。siRNA-转染HeLa细胞未经处理（0 h）或用10μM CHX处理2或4 h，并分析EGFR蛋白水平。图表显示了来自五个独立实验的EGFR蛋白的平均量，标准化为GAPDH，相对于0小时的相应siRNA和SEM**P（P）< 0.01. (C)激活EGFR。将siRNA-转染的HeLa细胞进行血清饥饿处理，用100 ng/mL EGF刺激，并分析EGFR和p-EGFR（EGFR-pY1173）水平。(D类)EGFR的泛化。细胞裂解物（输入），按C用EGFR抗体进行免疫沉淀（在限制条件下提取等量的EGFR），并通过免疫印迹分析EGFR泛素化。
图5。
图5。
在Cu3耗尽后，EGF-TxRed与LAMP1阳性LE/LYs的共定位延长。(A类–C)将siRNA-转染的HeLa细胞进行血清饥饿处理，用EGF-TxRed（100 ng/mL）脉冲处理5分钟，然后用全培养基追踪。细胞被固定并用EEA1抗体染色(A类)，人力资源(B)，或LAMP1(C).n个>每个时间点和条件200个单元格。条形图表示至少三个独立实验的SEM平均值。P（P）计算siControl和siCul3共定位之间的值，并与最大值进行比较(图S3A类). 这个P（P）EGF与EEA1和HRS共定位的值，或LAMP1共定位的其他时间点的值在统计学上不显著。（比例尺：10μm）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图6。
图6。
Cul3缺失细胞中LE/LY形态发生畸变。(A类)Cu3耗竭导致LE/LY的积累。用CD63抗体（绿色）和DRAQ5细胞核（蓝色）对siRNA-转染的HeLa和A549细胞进行染色。图像是z（z）-共焦切片的投影。图中显示了与细胞相关的总CD63免疫荧光的FACS测量。条形代表SEM的平均值，标准化以控制来自三个独立实验的siRNA**P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05. (B)LysoTracker Green DND-26染色活siRNA转染HeLa细胞。如相差图像所示，一些Cul3缺失的细胞显示出高度空泡化的表型。(C)mRFP-Rab5、EGFP-Rab7和siRNA共同转染的HeLa细胞，实时成像。(D类)定量稳定转染HeLa细胞的空泡化表型，并诱导EGFP-Rab7表达。条形代表SEM的平均值，其中n个>300个细胞，来自三个独立的实验**P（P）< 0.01. (E类)液体相标记物Dextran-Alexa Fluor 488负载细胞的实时成像。(F类)siRNA-转染HeLa细胞的薄片电镜。（比例尺：A类，20微米；B、 C类、和E类，10微米；F类，1微米）
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