跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并且被安全地传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2012年2月；23（4）：716-28。
doi:10.1091/mbc。E11-06-0530。 Epub 2011年12月21日。

LAS1L与哺乳动物Rix1复合物相互作用调节核糖体的生物发生

克里斯托弗城堡 1, 埃里卡·卡西梅尔, 凯瑟琳·丹尼科特
附属公司

LAS1L与哺乳动物Rix1复合物相互作用以调节核糖体的生物发生

克里斯托弗·D·卡斯尔等。 分子生物学细胞. 2012年2月.

摘要

RNA聚合酶I转录与前rRNA加工、前核糖体颗粒组装和核输出的协调是一个微调过程，需要许多辅助因子的协同作用。然而，其中一些蛋白质的确切功能以及它们在亚复合物中的组装方式尚不明确。LAS1L最初被描述为60S前核糖体亚单位成熟所需的核仁蛋白。在本文中，我们证明LAS1L与PELP1、TEX10和WDR18（芽殖酵母Rix1复合体的哺乳动物同源物）以及NOL9和SENP3相互作用，形成一种新的核仁复合体，与60S前核糖体亚基共分。LAS1L相关蛋白的耗竭导致p53依赖性G1阻滞，并导致前rRNA内部转录间隔区2区域的加工缺陷。我们进一步表明，该复合物的核仁定位需要活性RNA聚合酶I转录和小泛素样修饰物特异性蛋白酶SENP3。综上所述，我们的数据确定了60S核糖体亚基合成所需的一种新型哺乳动物复合体，进一步揭示了高等真核生物核糖体生物生成的复杂但描述不足的过程。

PubMed免责声明

数字

图1：
图1：
LAS1L相关蛋白的分离。（A） 使用与蛋白G Sepharose珠偶联的抗LAS1L抗体从HEK 293T细胞裂解液中亲和纯化LAS1L。以正常兔IgG作为阴性对照。在SDS-PAGE上分离LAS1L相关复合物，并进行银染，切断仅存在于LAS1L IP通道中的条带，用胰蛋白酶消化，并通过质谱分析。识别的蛋白质用箭头标记。（B） （A）中鉴定的蛋白质及其对应的酿酒酵母推定同源物（Rout等。, 1997; Jakel和Gorlich，1998年；巴斯勒等。, 2001; 瓦德拉穆迪等。, 2001, 2004; 彭等。, 2003; 加拉尼等。, 2004; 克洛根等。, 2004; 龚和叶，2006；潘泽等。, 2006; 奈尔等。, 2007; 海德尔等。, 2008; 云等。, 2008; 布拉利亚等。, 2010; 周等。, 2010; Heindl和Martinez，2010年；芬克拜纳等。, 2011).
图2：
图2：
LAS1L与PELP1、TEX10、WDR18、RanBP5、NOL9和SENP3关联。（A） LAS1L与来自HEK 293T细胞裂解物的抗LAS1L特异性抗体免疫沉淀（IP）。相关蛋白在SDS-PAGE上分离，并用特异性抗体（如左图所示）进行Western blotting分析。使用正常兔IgG作为阴性对照。WCL，全细胞裂解物；*，存在一个不特定的乐队。（B） PELP1与来自HEK 293T细胞裂解物的抗PELP1抗体免疫沉淀（IP）。相关蛋白在SDS-PAGE上分离，并用特异性抗体（如左图所示）进行Western blotting分析。以正常兔IgG作为阴性对照。WCL，全细胞裂解物。（C） 用非靶向对照（用字母“C”表示）或LAS1L siRNA转染HEK 293T细胞48小时。用抗PELP1抗体溶解细胞并免疫沉淀。在没有LAS1L的情况下，在SDS-PAGE上分离与PELP1相关的蛋白质，并用特异性抗体（如左图所示）进行蛋白质印迹分析。使用正常兔IgG作为阴性对照。WCL，全细胞裂解物；*，存在非特定带；#，IgG带。
图3：
图3：
LAS1L相互作用蛋白的耗竭诱导p53依赖的G1细胞周期阻滞。（A） 转染对照、LAS1L、PELP1、TEX10、NOL9、SENP3和WDR18 siRNA的HCT116细胞的细胞周期曲线。转染72小时后，用BrdU脉冲标记细胞30分钟，用碘化丙啶染色，并用流式细胞仪分析细胞G1期和S期的百分比。误差条表示三次重复实验的SD。（B） 用特异性p53、p21和β-actin抗体对来自（A）的siRNA-转染细胞进行Western blot分析。（C） 从面板（A）的siRNA-转染细胞中提取总RNA，并用基因特异性引物通过qRT-PCR确认敲除。每个基因特异性引物的相对mRNA水平归一化为β-肌动蛋白。误差条表示三次重复实验的SD。
图4：
图4：
LAS1L相关蛋白定位于核仁。具有复杂蛋白特异性抗体的U2OS细胞的免疫荧光分析。用0.1%Triton预先提取细胞，固定，并用抗LAS1L、PELP1、TEX10、NOL9和WDR18抗体（绿色）进行免疫染色。使用抗SENP3抗体（红色）证实了SENP3的结肠化作用。通过用Hoechst 33342（蓝色）染色来观察DNA。比例代表所有三个面板。
图5：
图5：
LAS1L相互作用蛋白与前60S核糖体颗粒共沉淀。HCT116细胞的核提取物通过10–30%蔗糖梯度离心分离。收集碎片，在260 nm（A）处测量光密度260). 指出了前40S和前60S天然亚基的位置。使用特定抗体（如左图所示）通过Western blotting证实每个组分中存在LAS1L复合蛋白。提取每个组分的总RNA并在1.2%甲醛凝胶上分离，然后使用ITS-2、28S和18S探针进行Northern印迹分析，如图所示。箭头表示32S、28S、18S和12S rRNA的位置。
图6：
图6：
LAS1L和NOL9与哺乳动物Rix1复合体在60S之前的核糖体颗粒上相互作用。HCT116细胞的核提取物通过10–30%蔗糖梯度离心分离。收集碎片，在260 nm（A）处测量光密度260). 基于A260然后将对应于游离核蛋白（1、2和3）、前40S核糖体颗粒（8、9和10）和前60S核糖体颗粒（12、13和14）的组分与兔IgG（A）作为阴性对照或与PELP1（B）或LAS1L（C）抗体结合并免疫沉淀（IP）。相关蛋白在SDS-PAGE上分离，并用特异性抗体（如左图所示）进行Western blotting分析。WCL，全细胞裂解物；*，存在非特定带；#，IgG带。
图7：
图7：
LAS1L相关蛋白是ITS-2正确加工所必需的。（A） 如图所示，主要47S rRNA转录物和rRNA中间产物的两条主要加工途径的示意图（改编自Hadjiolova等。, 1993). （B） Northern blot分析转染对照、LAS1L、PELP1、TEX10、NOL9、SENP3、RanBP5和WDR18 siRNA的HCT116细胞的总RNA。转染72小时后，等量的总RNA与ITS-1、ITS-2、28S和18S rRNA中间产物的特异探针杂交（如右图所示）。右侧面板显示每个探针的较长曝光时间。用于Northern印迹分析的特定探针的位置如图（A）所示。（C） 32S/28S、12S/28S和30S/28S比值是通过定量分析32S、30S和28S rRNA中间产物在较低暴露水平和12S rRNA中间体在较长暴露水平（B）中的相对带强度来确定的。将强度归一化为对照siRNA处理样品。（D） 用基因特异性引物通过qRT-PCR确认敲除。将每个基因特异性引物的相对mRNA水平标准化为β-肌动蛋白。误差条表示三次重复实验的SD。
图8：
图8：
PELP1需要激活Pol I转录来进行核仁定位。（A） 用二甲基亚砜或20 nM放线菌素D处理U2OS细胞2 h。用抗PELP1抗体（绿色）和抗UBF1抗体（红色）固定细胞并进行免疫染色。用Hoechst 33342（蓝色）染色观察DNA。刻度代表两个面板。（B） 如（A）所示，用DMSO（−）或放线菌素D（+）处理细胞，用抗PELP1抗体免疫沉淀（IP）裂解物。相关蛋白在SDS-PAGE上分离，并用特异性抗体（如左图所示）进行Western blotting分析。以正常兔IgG作为阴性对照。WCL，全细胞裂解物。
图9：
图9：
SENP3是LAS1L和PELP1核仁定位所必需的。（A） 用对照或SENP3 siRNA转染HCT116细胞72小时。固定细胞并用抗LAS1L（绿色）和抗SENP3（红色）抗体进行免疫染色。用Hoechst 33342（蓝色）染色观察DNA。比例代表所有面板。（B） 用对照或SENP3 siRNA转染HCT116细胞72 h。细胞固定并用抗PELP1（绿色）和抗SENP3（红色）抗体进行免疫染色。通过用Hoechst 33342（蓝色）染色来观察DNA。比例代表所有面板。（C） 用对照（−）或SENP3（+）siRNA转染细胞72 h。然后用兔IgG（作为阴性对照）或PELP1抗体免疫沉淀裂解液。共沉淀蛋白在SDS–PAGE上分离，并使用特定抗体（如左图所示）通过Western blotting进行分析。WCL，全细胞裂解物；*，存在非特定带；#，IgG带。
图10：
图10：
LAS1L和PELP1核仁定位需要NPM1。（A） 用对照或NPM1 siRNA转染HCT116细胞48小时。使用LAS1L抗体（绿色）通过免疫荧光分析确定LAS1L的亚细胞定位。用Hoechst 33342（蓝色）染色观察DNA。比例代表所有面板。（B） 用对照或NPM1 siRNA转染HCT116细胞48小时。使用PELP1抗体（绿色）通过免疫荧光分析确定PELP1的亚细胞定位。用Hoechst 33342（蓝色）染色观察DNA。比例代表所有面板。（C） 使用特异性抗体（如左图所示）通过免疫印迹法确认（A）和（B）NPM1的敲除。使用抗CDK2抗体作为负荷控制。（D） 用对照（“C”）或NPM1 siRNA转染细胞72小时。然后用兔IgG（作为阴性对照）或PELP1抗体免疫沉淀裂解液。共沉淀蛋白在SDS–PAGE上分离，并使用特定抗体（如左图所示）通过Western blotting进行分析。WCL，全细胞裂解物。
图11：
图11：
SUMO以SENP3依赖方式修改LAS1L和PELP1。（A） 用FLAG-LAS1L（+）加上空载体（−）或表达6xHis标记的SUMO-1或SUMO-3（+）的质粒转染HEK 293T细胞。转染48小时后，使用Ni-NTA琼脂糖珠从细胞裂解液中提取SUMOylated蛋白。洗脱液在SDS-PAGE上进行分析，并用所示抗体进行免疫印迹。（B） 用对照（−）或SENP3（+）siRNA转染HEK 293T细胞。第二天，用空载体（−）或6xHis标记的SUMO-3（+）表达质粒转染细胞。转染48小时后，如（A）所述进行下拉和蛋白质分析。（C） 用对照（−）或NPM1（+）siRNA转染HEK 293T细胞。第二天，用空载体（−）或表达6xHis标记SUMO-3（+）的质粒转染细胞。转染48小时后，按（A）进行下拉和蛋白质分析。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Arabi A等人c-Myc与核糖体DNA结合并激活RNA聚合酶I转录。自然细胞生物学。2005;7:303–310.-公共医学
    1. Bassler J、Grandi P、Gadal O、Lessmann T、Petfalski E、Tollervey D、Lechner J、Hurt E。与核输出密切相关的60S前核糖体颗粒的鉴定。分子细胞。2001;8:517–529.-公共医学
    1. Boisvert FM，van Koningsbruggen S，Navascuse J，Lamond AI.多功能核仁。Nat Rev Mol细胞生物学。2007;8:574–585.-公共医学
    1. Braglia P、Heindl K、Schleiffer A、Martinez J、Proudfoot NJ。RNA/DNA激酶Grc3在RNA聚合酶终止转录中的作用I.EMBO Rep.2010；11:758–764.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Budde A，Grummt I.p53抑制核糖体基因转录。致癌物。1999;18:1119–1124.-公共医学