Neuronal differentiation by TAp73 is mediated by microRNA-34a regulation of synaptic protein targets

doi:10.1073/pnas.1112061109

.2011年12月27日；108(52):21093-8.

doi:10.1073/pnas.1112061109。 Epub 2011年12月12日。

TAp73介导的神经元分化是通过调节突触蛋白靶点的microRNA-34a介导的

马西米利亚诺·阿戈斯蒂尼¹, 保拉·图奇, 理查德·基利克, 坎迪Eleonora, 伯纳·萨扬, 皮亚·里维蒂（Pia Rivetti di Val Cervo）, 尼科特拉（Pierluigi Nicotera）, 麦基翁, 理查德·奈特, Tak W Mak公司, 格里·梅利诺

附属公司

PMID： 22160687
预防性维修识别码：项目经理3248477
内政部： 10.1073/pnas.112061109

TAp73介导的神经元分化是通过调节突触蛋白靶点的microRNA-34a介导的

马西米利亚诺·阿戈斯蒂尼等。美国国家科学院程序. 2011.

.2011年12月27日；108(52):21093-8.

doi:10.1073/pnas.1112061109。 Epub 2011年12月12日。

作者

马西米利亚诺·阿戈斯蒂尼¹, 保拉·图奇, 理查德·基利克, Eleonora Candi公司, 伯纳·萨扬, 皮亚·里维蒂（Pia Rivetti di Val Cervo）, 尼科特拉（Pierluigi Nicotera）, 麦基翁, 理查德·奈特, Tak W Mak公司, 格里·梅利诺

附属

¹英国莱斯特LE1 9HN莱斯特大学医学研究委员会毒理学组。

PMID： 22160687
预防性维修识别码：项目经理3248477
内政部： 10.1073/pnas.112061109

摘要

p53家族成员TAp73是一种转录因子，在许多生物过程中起着关键作用。在这里，我们表明p73通过作用于miR-34a启动子上的特定结合位点来驱动microRNA（miR）-34a的表达，而不是miR-34b和-c的表达。在神经母细胞瘤细胞和皮层神经元的体外分化过程中，miR-34a的表达与TAp73的表达平行调节。p73或miR-34a的敲低可抑制视黄素驱动的神经母细胞瘤分化。体内p73（-/-）小鼠皮层和海马miR-34a的转录表达显著降低；当突触发生时，miR-34a和TAp73的表达在出生后大脑和小脑的发育过程中也会增加。因此，miR-34a的过度表达或沉默会反向调节突触靶点的表达，包括突触凝集素-1和突触融合蛋白-1A。值得注意的是，轴TAp73/miR-34a/synaptotagmin-1在阿尔茨海默病患者的大脑中是保守的。这些数据强化了TAp73在神经元发育中的作用。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
TAp73促进miR-34a的表达和皮层神经元的体外终末分化。(一)用多西环素处理SAOS-2-TAp73β诱导细胞系24小时，以过度表达人TAp73蛋白(插入，Western blot）。通过实时PCR评估miRs-34a、-34b和-34c的内源性水平。(B类)用多西环素处理SAOS-2-TAp73β诱导细胞株的指示时间，并通过实时PCR评估pri-miR-34a、pre-miR-34和miR-34的内源性水平**P（P）*< 0.05. (C类)分析包含p53共识位点的miR-34a启动子区域在−1472和+551 bp之间的TAp73β反应性。在荧光素酶报告基因中插入该miR-34a启动子区域，导致SAOS-2细胞中TAp73β存在时荧光素酶活性增加。(D类)TAp73在RA诱导的神经母细胞瘤细胞系终末分化中调节miR-34。用10μM RA处理SHSY-5Y细胞，用Western blot检测TAp73、p21和β-微管蛋白的表达。通过实时PCR评估miR-34a的表达(下部，直方图）。(E类)p73siRNA可防止RA治疗后前驱体miR-34a和miR-34a的上调**P（P）*< 0.05. (F类)未经处理或经RA处理的SHSY-5Y细胞的ChIP检测。用抗TAp73或IgG作为对照抗体免疫沉淀蛋白-色素复合物。使用针对hsa-miR-34a启动子区域设计的引物进行RT-PCR，该启动子区域包含预测和验证的p53结合位点。(*G公司*)SHSY-5Y中未转染（ctrl）的神经突起生长，或转染加扰、siRNAp73或抗miR-34a，然后用RA处理48小时**P（P）*< 0.05. (*H（H）*和我)在DIV2、-5、-6和-7培养的皮层神经元中对三种不同的神经元标记物和GAPDH进行Western blot分析。Syn II（Synapsin II）。(J型和*K（K）*)在指定的时间点收集皮层神经元，并分别通过Western印迹和实时PCR评估miR-34a和TAp73的表达。数据表示三个不同实验的平均值±SD**P（P）*= 0.016. (*L（左）*)野生型和TAp73之间miR-34a的相对表达比较^−/−和第73页^−/−小鼠终末神经元分化期间。数据被归一化为家务基因*斯诺202*相对于DIV2。数据表示三个不同实验的平均值±SD**P（P）*= 0.045.

**图2。**
体内miR-34a和TAp73的表达。(一)p73中miR-34a的表达减少^−/−老鼠。从p73中分离出皮层和海马^+/+，第73页^+/−和第73页^−/−小鼠(n个= 5–9; 年龄、P2）和miR-34a水平通过实时PCR进行评估***P（P）*< 0.01. (B类)通过激光捕获显微切割从p73分离皮层和海马的不同区域^+/+和p73^−/−通过实时PCR评估小鼠和miR-34a水平。数据表示三个不同实验的平均值±SD**P（P）*< 0.05. (C类)小脑是从WT小鼠中分离出来的(n个=每点4个），并在小脑发育期间通过出生时实时PCR（P0）和随后的出生后几天评估miR-34a和TAp73的表达。(D类)p73小脑miR-34a的相对表达^+/+和p73^−/−小鼠在发育过程中。数据被归一化为家务基因*斯诺202*相对于P1。数据表示三个不同实验的平均值±SD**P（P）*= 0.045.

**图3。**
miR-34a调节突触标志物的表达。(一)用miR-34a前体或加扰对照（加扰）转染WT皮层神经元（DIV3），24小时后，通过实时PCR检测几种神经元标记物的mRNA水平。Stx（syntaxin）、Syn（synapsin）、Syt（synaptotagmin）。数据代表三个不同实验的平均值±标准差**P（P）*= 0.01. (B类)在荧光素酶报告基因上游插入Syt-I 3′UTR或Stx1A 3′UTR-（WT或缺失）表明存在前体miR-34a中的荧光素酶活性降低。该检测在HEK 293E细胞中进行。数据表示三个不同实验的平均值±SD**P（P）*= 0.03. (C类)用前体miR-34a（Pre-34a）或干扰对照（Scramble）转染皮层神经元72 h，并分析细胞裂解物中Syt-I和Stx-1A的表达。(D类)用抗miR-34a或加扰对照（加扰）转染WT皮层神经元（DIV3），24小时后，通过实时PCR测定所示突触蛋白的mRNA水平。数据表示三个不同实验的平均SD**P（P）*= 0.03. (E类)DIV2转染抗miR-34a或干扰对照的皮层神经元蛋白质的Western blot分析。肌动蛋白或GAPDH被用作负荷控制。低于Western blot的数字表明突触蛋白归一化为肌动蛋白或GAPDH的相对水平与扰乱控制有关。(F类)通过激光捕获显微切割分离小脑的指示细胞层(图S7)并通过实时PCR评估miR-34a和Syt-I的水平。数据被归一化为家务基因*斯诺202*或相对于颗粒细胞层表达的GAPDH。数据表示三个不同实验的平均值±SD。

**图4。**
AD脑中miR-34a、TAp73和突触蛋白的表达。(一)从死后对照组和AD海马提取总RNA。通过实时PCR评估指示基因的表达。数据表示平均值±SEM**P（P）*< 0.05. (B类)个别AD样本的Pearson检验显示TAp73和miR-34a表达之间存在显著正相关。(C类)miR-34a与Syt-1呈显著负相关。(D类)TAp73/miR-34a轴在发育性神经元分化中作用的示意模型。

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