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.2011年11月；1(6):524-38.
doi:10.1158/2159-8290.CD-11-0124。 Epub 2011年9月13日。

癌基因EGFR信号激活mTORC2-NF-κB通路，促进化疗耐药

田中和弘 1, 伊万·巴比奇, 大卫·内森森, 大卫·阿卡万, 郭德良, 比阿特丽斯·基尼, 朱莉·丹, 朱少军, 杨慧君, 杰森·德·耶稣, 阿里·内尔·阿姆扎杰尔迪, 张一男（音）, 克里斯蒂安·迪布尔, 汉彩丹, 阿曼达·林肯堡, 威廉·H·勇, 哈里·文特斯, 约瑟夫·杰拉, 韦伯斯特·K·卡文尼, 蒂莫西·F·克劳西, 布伦丹·D·曼宁, 阿尔伯特·S·鲍德温, 保罗·米舍尔
附属公司

癌基因EGFR信号激活mTORC2-NF-κB通路，促进化疗耐药

田中和弘等。 癌症发现. 2011年11月.

摘要

虽然已知mTOR复合物2（mTORC2）在Akt上游发挥作用，但这种蛋白激酶复合物在癌症中的作用尚不清楚。通过对细胞系、体内模型和临床样本的综合分析，我们证明mTORC2在胶质母细胞瘤（GBM）中频繁激活，GBM是成人最常见的恶性原发性脑肿瘤。我们发现，共同激活表皮生长因子受体（EGFR）突变（EGFRvIII）刺激mTORC2激酶活性，而PTEN部分抑制了mTORC1激酶活性。mTORC2信号转导促进GBM生长和存活并激活NF-κB。重要的是，该mTORC2-NF-κB通路使GBM细胞和肿瘤以独立于Akt的方式对化疗产生耐药性。这些结果强调了mTORC2在GBM发病机制中的关键作用，包括通过激活突变EGFR下游的NF-κB，导致以前未被认识到的癌症化疗抵抗功能。这些发现表明，以mTORC2为靶点的治疗策略，无论是单独治疗还是联合化疗，在癌症治疗中都是有效的。

意义：本研究表明EGFRvIII激活的mTORC2信号通过NF-κB的Akt-非依赖性激活促进GBM增殖、存活和化疗抵抗。这些结果强调了mTORC2作为两个典型信号网络（EGFR/磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和NF-κB）的整合者的作用，这两个网络在癌症中普遍改变。这些结果也证实了mTORC2作为肿瘤靶点的重要性，并为其在介导化疗耐药中的作用提供了新的见解，提出了新的治疗策略。

关键词：EGFRvIII；核因子-κB；利克托；以及对母性的抵抗；mTORC2号机组。

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数字

图1
图1。EGFRvIII刺激mTORC2激活在体外和体内
（A） 使用U87等基因细胞对mTORC2生物标记物上的EGFRvIII/EGFR信号进行生化分析。细胞系在无血清培养基中培养24小时。（B） 将EGFRvIII置于强力霉素可调节启动子下的LN229 GBM细胞的免疫印迹分析。（C） 代表性免疫组织化学图像显示p-EGFR（Y1068）、p-Akt（S473）和p-NDRG1（T346），以评估EGFRvIII介导的mTORC2信号。比例尺，20μm。（D） PTEN重组对EGFRvIII介导的mTORC2信号传导的影响。（E） 将U87等基因细胞的裂解液与Rictor抗体或对照IgG进行免疫沉淀。以昆虫细胞纯化的Akt1为底物，将蓖麻免疫沉淀物分成等分进行单独的激酶反应。将PP242添加到EGFRvIII细胞的激酶反应中。通过Akt S473磷酸化评估mTORC2体外激酶活性。（F） EGFRvIII模拟mTORC2信号的模式。另请参见补充图S1。
图2
图2。mTORC2促进GBM细胞生长，对雷帕霉素治疗耐药，其抑制作用具有抗肿瘤作用
（A） 将Rictor siRNA或干扰对照siRNA构建物转染U87和U87/EGFRvIII细胞48小时，置于96 well平板中。用细胞增殖试验计算相对细胞生长。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（统计显著，*p<0.05，NS；不显著）。（B） 将表达myc-Rictor的载体或空载体转染U87细胞48小时，置于96周平板中。用细胞增殖试验计算相对细胞生长。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.001）。IP；免疫沉淀法；免疫印迹分析（C）接受雷帕霉素治疗的GBM患者肿瘤样本中p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-S6（S235/236）染色（红棕色）的免疫组织化学图像。组织用苏木精复染。比例尺，50μm。（D） 用siRNA Rictor和/或雷帕霉素处理U87/EGFRvIII细胞，对p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-S6（S235/236）进行免疫印迹分析。（E） 免疫印迹分析使用U87/EGFRvIII和U251MG细胞的指示抗体以及针对猛禽、立克次体或扰乱对照的siRNA。（F） 在6孔板中用针对Raptor、Rictor或打乱对照的siRNA构建物转染U87/EGFRvIII细胞24小时，并改为1%FBS培养基3天。用台盼蓝排斥法测定细胞死亡。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.05，**p<0.01）。（G） U251MG细胞在6孔板中转染抗猛禽、立克次体或干扰对照的siRNA构建物24小时，并换成1%的FBS培养基3天。用台盼蓝排斥法测定细胞死亡。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.05，**p<0.01，#p<0.05,#p<0.01.）。另请参见补充图S2、3和4。
图3
图3。EGFRvIII通过mTORC2激活NF-κB
（A） U87等基因细胞全细胞提取物中p-p65（S536）、p-IκBα（S32/36）和NF-κB靶基因如Bcl-xl和cyclinD1的免疫印迹分析。（B） 使用U87等基因细胞在无血清培养基中培养48小时后裂解的核提取物进行EMSA。箭头表示DNA/蛋白质EMSA复合物。p65和TBP的免疫印迹分析，用于使核提取物的蛋白质负荷正常化。（C） 荧光素酶报告子使用U87等基因细胞（测量为相对荧光素酶/发光单位）分析靶向NF-κB信号转导。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.01，**p<0.05）。（D） U87/EGFRvIII细胞中Rictor敲低NF-κB信号的生化分析。细胞系在无血清培养基中培养24小时后，转染抗Rictor和Scramb的siRNA。（E） 使用RT-PCR方法评估敲除Rictor和打乱后U87/EGFRvIII细胞NF-κB靶基因表达mRNA水平的变化。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM。（F） U87细胞NF-κB信号转导中Rictor过度表达的生化分析。在转染myc-Rictor表达载体或空载体后，细胞系在无血清培养基中培养24小时。（G） EMSA使用用myc-Rictor表达载体和编码IκB超级阻遏物（IκBα-SR；人类IκBα的显性阴性突变体）的腺病毒转染的U87细胞的核提取物。箭头表示DNA/蛋白EMSA复合物，P；阳性对照，C；控制LacZ。（H） 荧光素酶报告子检测用myc-Rictor表达载体和编码IκBα-SR的腺病毒转染的U87细胞中NF-κB信号的靶向性。数据表示三个独立实验的平均+/-扫描电镜（统计显著，*p<0.001，**p<0.000），C；控制LacZ（I）EGFRvIII通过mTORC2刺激NF-κB的模式。另请参见补充图S5、6、7、8和9。
图4
图4。mTORC2通过NF-κB介导EGFRvIII依赖性化疗耐药，与Akt无关
（A） 用不同剂量的顺铂（CDDP）处理48小时后，U87、U87/EGFRvIII、U87/EGFRvIII+加扰对照siRNA和U87/EGFR vIII+Rictor siRNA细胞的相对细胞增殖。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM。（B） 使用转染有抗Rictor siRNA的U87MG和U87/EGFRvIII的指示抗体进行免疫印迹分析，并用CDDP或生理盐水处理打乱对照。（C） 用CDDP或生理盐水处理的编码IκBα-SR的腺病毒感染U87/EGFRvIII的指示抗体进行免疫印迹分析。（D） 用抗Akt1-3、Rictor和CDDP（1μg/ml）或生理盐水处理的打乱对照的siRNA转染U87/EGFRvIII细胞的TUNEL染色。凋亡细胞的百分比是使用NIH图像计算各组400个细胞中TUNEL阳性细胞的百分比。数据代表三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.01，NS；不显著）。图像放大100倍。（E） 用Akt抑制剂（2.5μM）处理myc-Rictor表达的U87细胞或在CDDP处理（1μg/ml）下编码IκBα-SR的转染腺病毒进行TUNEL染色。D类；DMSO。凋亡细胞的百分比是使用NIH图像计算各组400个细胞中TUNEL阳性细胞的百分比。数据代表三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.01，NS；不显著）。另请参见补充图S9、10、11和12。
图5
图5。mTORC2抑制逆转化疗耐药体内
（A） 每只小鼠皮下注射3×105U87/EGFRvIII shRNA控制细胞（左侧）和3×105U87/EGFRvIII shRNA Rictor细胞（右侧）。用顺铂（CDDP）腹腔注射（3mg/kg体重）治疗荷瘤小鼠。对照组接受等体积（100μl）的生理盐水（NS）。植入10天后开始治疗。在指定的时间点，测量来自6只小鼠的异种移植物的肿瘤体积。按照材料和方法测量肿瘤体积（折叠）。数据代表平均+/-SEM（具有统计学意义，**p<0.01，*p<0.05）。（B） shRNA Rictor和CDDP或生理盐水治疗的对照组肿瘤的代表性图像。（C） 使用CDDP或生理盐水治疗的小鼠中U87/EGFRvIII shRNA对照的肿瘤裂解物和shRNA Rictor细胞的指示抗体进行免疫印迹分析。（D） 典型图像显示p-p65（S536）和TUNEL染色（棕色细胞）以评估凋亡效应。使用NIH图像对TUNEL染色进行量化。数据表示三个独立图像的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.001）。比例尺，20μm。另请参见补充图S13。
图6
图6。mTORC2信号在大多数临床GBM样本中过度激活，与NF-κB和磷酸化-EGFR相关
（A） 组织芯片（TMA）分析中EGFR/mTORC2/NF-κB信号的每个相关性模式。P（P）-独立性检验采用卡方检验确定值和比值比（OR）。（B） 140例原发性GBM患者252个肿瘤核心组成的两个TMA中p-EGFR（Y1068）、p-Akt（S473）、Rictor、p-NDRG1（T346）和p-p65（S536）染色的免疫组织化学图像（红棕色）。组织用苏木精复染。比例尺，20μm。（C） 基于p-p65（S536）与p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-EGFR（Y1068）相关性的TMA免疫组织化学分析。由于缺少岩芯，数字加起来可能不到252。P（P）-该值由独立性检验的Chi-square确定（具有统计学意义，**p<0.001，*p<0.05）。（D） 尸检时获得的GBM患者脑部肿瘤组织（T）和对侧正常脑组织（N）的典型大体和显微镜照片。比例尺，100μm。（E） 尸检获得的三名GBM患者肿瘤（T）和对侧正常脑组织（N）中Rictor、p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-p65（S536）染色的免疫印迹分析。另见补充表S1。
图7
图7。EGFRvIII通过mTORC2刺激NF-κB活性
（A） EGFRvIII刺激mTORC2活性；PTEN抑制其（B）mTORC2促进NF-κB活性。（C） mTORC2介导EGFRvIII刺激的NF-κB活化，促进肿瘤生长、生存和化疗抵抗。
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