Administration of BMP2/7 in utero partially reverses Rubinstein-Taybi syndrome-like skeletal defects induced by Pdk1 or Cbp mutations in mice

doi:10.1172/JCI59466

。2012年1月；122(1):91-106.

doi:10.1172/JCI59466。 Epub 2011年12月1日。

子宫内注射BMP2/7可部分逆转Pdk1或Cbp突变诱导的Rubinstein-Taybi综合征样骨骼缺陷

Jae-Hyuck垫片¹, 马修·B·格林布拉特, 安朱·辛格, 尼古拉斯·布雷迪, 胡多萝西, 丽贝卡·德拉普, 小川和太郎, Masato Kasuga公司, 野田忠雄, 桑华阳, 李桑奎, 薇薇安一世叛逆, 劳里·H·格利姆彻

附属公司

PMID： 22133875
预防性维修识别码：项目经理3248303
内政部： 10.1172/JCI59466

子宫内注射BMP2/7可部分逆转Pdk1或Cbp突变诱导的Rubinstein-Taybi综合征样骨骼缺陷

Jae Hyuck垫片等。临床研究杂志。 2012年1月。

。2012年1月；122(1):91-106.

doi:10.1172/JCI59466。 Epub 2011年12月1日。

作者

Jae-Hyuck垫片¹, 马修·格林布拉特, 安居·辛格, 尼古拉斯·布雷迪, 胡多萝西, 丽贝卡·德拉普, 小川和太郎, Masato Kasuga公司, 野田忠雄, 桑华阳, 李桑奎, 薇薇安一世叛逆, 劳里·H·格利姆彻

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿哈佛公共卫生学院免疫学和传染病系。jshim@hsph.harvard.edu

PMID： 22133875
预防性维修识别码：项目经理3248303
内政部： 10.1172/JCI59466

勘误表in

临床投资杂志。2012年5月1日；122(5):1948

摘要

辅活化因子CREB结合蛋白（CBP）的突变是人类骨骼发育不良Rubinstein-Taybi综合征（RTS）的主要病因；然而，这些突变影响骨骼矿化和模式化的机制尚不清楚。在这里，我们报告了3-磷酸肌醇依赖性激酶1（PDK1）作为CBP活性的关键调节器的鉴定，并证明其功能与骨祖细胞和成熟成骨细胞相匹配。在成骨细胞中，PDK1激活CREB/CBP复合物，后者反过来控制runt-related transcription factor 2（RUNX2）的激活和骨形态发生蛋白2（BMP2）的表达。这些途径也在体内运行，如小鼠（Pdk1osx小鼠）中RTS谱表型与成骨细胞特异性Pdk1缺失的重演，以及小鼠中观察到的成骨细胞特异性Pdkl缺失和Runx2或Creb缺失的杂合基因相互作用所证明。最后，在子宫内用BMP治疗Pdk1osx和Cbp+/-胚胎可以部分逆转出生时的骨骼异常。这些发现说明了PDK1-AKT-CREB/CBP通路在骨形成中的体内功能，并为子宫内补充生长因子作为骨骼发育不良的潜在治疗提供了原理证明。

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数字

**图1。PDK1缺陷小鼠骨骼发育异常。**
(A类)P2骨化*预测值k1^{飞行/飞行}*和*预测值k1^奥斯克斯*头骨用μCT进行分析。箭头表示鼻骨。(B类)Alizarin Red/Alcian Blue染色的骨骼标本显示P2期颅骨低矿化和锁骨发育不全*预测值k1^奥斯克斯*老鼠。箭头表示颧骨（顶部）。P2股骨苏木精和伊红染色纵切面*预测值k1^{飞行/飞行}*和*预测值k1^奥斯克斯*小鼠（中间）。*预测值k1^奥斯克斯*小鼠表现为低骨量和自发性骨折（下图）。原始放大倍数，×40。(C类和D类)茜素红/阿尔西安蓝染色的小鼠骨骼标本。

**图2。骨祖细胞的特征及其基因表达*预测值k1^奥斯克斯*老鼠。**
(A类)预选、活CD45的代表性FACS特征^–第119条^–从E17.5长骨中获取的谱系细胞*预测值k1^{飞行/飞行}*和*预测值k1^dm1型*胚胎。百分比表示该象限内单元格的百分比。数值为生物复制品的平均值±SD。(B类)P2矢状缝切片*Pdk1型^{飞行/飞行}*和*预测值k1^奥斯克斯*新生儿表达*Opn（操作）*原位杂交。原始放大倍数，×100。标记成骨前缘（OF）和缝合间质（SM）。(C类)从P2头盖骨中提取总RNA预测值k1^{飞行/飞行}和*预测值k1^奥斯克斯*用定量PCR分析小鼠成骨细胞基因表达。每个样本（每个样本来自不同的鼠标）的值用圆圈表示，每组的平均值用红线表示。

**图3。PDK1缺陷成骨细胞的特征。**
(A类和B类)*预测值k1^{飞行/飞行}*将被对照（con）或表达Cre的慢病毒（ΔPDK1）感染的CalvObs培养6天，并分析ALP活性和Von-Kossa染色，或通过定量PCR进行分析。(C类和D类)*Pdk1型^{飞行/飞行}*CalvObs感染对照组或表达Cre的慢病毒，在没有或存在IGF-1（25 ng/ml）的情况下培养6天，并且(C类)分析ALP活性或(D类)定量PCR分析。原始放大倍数，×100。

**图4。缺乏PDK1的成骨细胞对IGF-1和胰岛素的反应改变。**
*预测值k1^{飞行/飞行}*CalvObs感染了对照组或表达Cre的慢病毒，血清饥饿12小时，并用(A类)IGF-1（25 ng/ml）或(B类)胰岛素（10 nM）。用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。

**图5。PDK1通过AKT激活成骨细胞中的CREB。**
(A类)*预测值k1^{飞行/飞行}*CalvObs感染对照或表达Cre的慢病毒，培养6天，并用所示抗体进行免疫印迹。箭头表示预测的磷酸化GSK-3β和S6蛋白。(B类)主要CalvObs从*预测值k1^{飞行/飞行}*和*预测值k1^奥斯克斯*新生儿和免疫印迹抗磷酸CREB抗体。或者，进行IHC以显示P2颅盖骨冠状切片中CREB的磷酸化水平*预测值k1^{飞行/飞行}*和*预测值k1^奥斯克斯*老鼠。原始放大倍数，×100。(C类)*预测值k1^{飞行/飞行}*用CREB-Luc和*雷尼利亚*荧光素酶基因。在分化培养基中培养6天后分析萤光素酶活性。结果标准化为*雷尼利亚*控制。(D类)*预测值k1^{飞行/飞行}*在IGF-1刺激（25 ng/ml）之前，感染对照或Cre表达慢病毒的CalvObs被血清饥饿12小时。然后用抗磷酸化CREB（S133）抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。

**图6。骨骼缺陷的特征*奶油色*^–/–老鼠。**
(A类)E18.5的骨化*奶油色^+/+*和*奶油色^–/–*利用μCT对颅骨进行分析，并显示三维重建结果。(B类)E18.5中股骨的苏木精和伊红染色纵切面*奶油色^+/+*和*船员^–/–*胚胎。原始放大倍数，×100。(C类)4周龄儿童股骨的μCT分析*预测值k1^{佛罗里达州/+}*，*预测值k1^{佛罗里达州/+}奥斯克斯*，*奶油色^+/–*、和*预测值k1^{佛罗里达州/+}osx；奶油色^+/–*老鼠。BV/TV、骨体积分数；Tb、。Th，小梁厚度；Tb、。N、小梁数；C.Th，皮层厚度***P（P）*<0.005，学生的吨测试。

**图7。PDK1在体外作用于RUNX2上游。**
(A类)*预测值k1^{飞行/飞行}*用OSE2-Luc或OSE1-Luc以及*雷尼利亚*荧光素酶基因。在分化培养基中培养6天后分析荧光素酶活性。结果标准化为*雷尼利亚*控制。(B类和C类)*预测值k1^{飞行/飞行}*CalvObs感染了对照或表达Cre的慢病毒以及表达Myc-RUNX2的慢毒，以及(B类)通过比色分析（顶部）和Fast Blue染色（底部）分析ALP活性。原始放大倍数，×100。(C类)或者，通过定量PCR分析所示基因的RNA转录水平。

**图8。PDK1在体内调节RUNX2。**
(A类)4周龄婴儿锁骨颅骨（顶部）和茜素红/阿尔西安蓝染色骨骼标本（底部）的μCT分析*预测值k1^{佛罗里达州/+}*，*预测值k1^{佛罗里达州/+}奥斯克斯*，*运行2^+/–*、和*预测值k1^{佛罗里达州/+}osx；运行2^+/–*老鼠。(B类)4周龄儿童股骨的μCT分析*预测值k1^{佛罗里达州/+}*，*预测值k1^{佛罗里达州/+}奥斯克斯*，*运行2^+/–*、和*预测值k1^{佛罗里达州/+}osx；运行2^+/–*老鼠。显示小梁骨（左）和中轴皮质骨（右）的三维重建**P（P）*<0.05，学生的吨测试***P（P）*< 0.005. (C类)4周龄婴儿自发性肋骨骨折*预测值k1^{佛罗里达州/+}*，*预测值k1^{佛罗里达州/+}操作系统*，*运行2^+/–*、和*Pdk1型^{佛罗里达州/+}osx；运行2^+/–*老鼠**P（P）*<0.05，学生的吨测试***P（P）*< 0.005.

**图9。PDK1通过CREB/CBP复合物调节RUNX2活性和BMP2表达。**
(A类)用所示结构转染C3H10T1/2细胞。荧光素酶活性测量并归一化为*雷尼利亚*控制。(B类)使用含有RUNX2结合位点（OSE2）的生物素化寡核苷酸进行DNA下拉分析。将Myc-RUNX2与HA-CBP、VP16/CREB或A-CREB联合转染HEK293细胞。用生物素化的OSE2寡核苷酸免疫沉淀核蛋白，并用抗Myc抗体免疫印迹。测量Myc-RUNX2蛋白的量作为输入对照。(C类)RUNX2与CBP的相互作用通过组成活性CREB增加。用Myc-RUNX2与VP16/CREB和HA-CBP组合转染HEK293细胞。细胞被裂解，用抗HA结合珠免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹。(D类)主要*预测值k1^{飞行/飞行}*CalvObs感染对照或表达Cre的慢病毒，并在分化条件下培养。用IgG或抗CBP免疫沉淀核蛋白，并用抗RUNX2免疫印迹。

**图10。BMP2是PDK1/CREB轴的目标。**
(A类)从P2头盖骨中提取总RNA预测值k1^{飞行/飞行}和*预测值k1^奥斯克斯*小鼠或E18.5奶油色^+/+和*奶油色^–/–*胚胎。的转录水平*Bmp2型*通过定量PCR进行分析。每个点代表一个独立胚胎的值。水平线表示平均值±SD(B类)主要CalvObs从*预测值k1^{飞行/飞行}*和*预测值k1^奥斯克斯*幼鼠，裂解，并用抗磷酸-Smad1/5/8抗体进行免疫印迹。或者，IHC显示P2颅盖骨冠状切片中SMAD1/5/8的磷酸化水平*预测值k1^{飞行/飞行}*和*预测值k1^奥斯克斯*老鼠。原始放大倍数，×40。(C类)用BMP2-Luc（-2712/+165 bp）转染C3H10T1/2细胞*雷尼利亚*荧光素酶基因以及载体Flag-CREB（WT）或VP16/CREB。结果表示为相对荧光素酶活性标准化为*雷尼利亚*控制。(D类)将含有CREB结合位点突变（mut1或mut2；mut1，-66/62 bp；mut2，+38/42 bp；WT，CGTCC；突变，GGCC）的WT或突变BMP2-Luc（-150/+165 bp）转染C3H10T1/2细胞*雷尼利亚*荧光素酶基因与Flag-CREB（WT）或VP16/CREB（ca）。结果表示为相对荧光素酶活性标准化为*雷尼利亚*控制。(E类)用Flag-CREB或Myc-RUNX2转染HEK293细胞，通过含有WT或突变CREB结合位点的生物素化寡核苷酸免疫沉淀核蛋白。

**图11。rhBMP2/7治疗逆转*预测值k1^奥斯克斯*胚胎和成骨细胞。**
(A类)P1骨骼异常的抢救*Pdk1型^操作系统*新生儿rhBMP2/7。P1的骨化*预测值k1^奥斯克斯*0.1%BSA/PBS或rhBMP2/7处理的颅骨通过μCT进行分析（上图）。Alizarin Red/Alcian Blue染色的锁骨（中部）骨骼标本和苏木精和伊红染色的P1预测值k1^{飞行/飞行}和*预测值k1^奥斯克斯*股骨（底部）如图所示。箭头表示自发性骨折。原始放大倍数，×100**P（P）*<0.01，学生的吨测试；*P（P）*<0.02（锁骨测量）和*P（P）*<0.0001（对于fontanelle测量），单因素方差分析。(B类)rhBMP2/7对PDK1缺陷CalvObs分化受损的修复。*Pdk1型^{飞行/飞行}*CalvObs感染对照或表达Cre的慢病毒，并在0.1%BSA/PBS或rhBMP2/7（100 ng/ml）存在下培养6天。分析所示基因的ALP活性和RNA转录水平。原始放大倍数，×40(A类，右）；×100 (B类).

**图12。rhBMP2/7治疗逆转*Cbp公司^+/–*胚胎。**
(A类)E18.5中骨骼异常的抢救*Cbp公司^+/–*rhBMP2/7诱导的胚胎。E18.5的骨化*Cbp公司^+/–*0.1%BSA/PBS或rhBMP2/7处理的颅骨用μCT进行分析，并显示三维重建（上图）。Alizarin Red/Alcian Blue染色的骨骼标本显示锁骨发育不良在*Cbp公司^+/–*用rhBMP2/7处理的胚胎（底部）。*P（P）*<0.0001，单因素方差分析**P（P）*<0.01，学生的吨测试。(B类)描述成骨细胞PDK1通路的模式。黑色箭头表示IGF-1信号通路；红色箭头和线条表示胰岛素分泌途径。

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[2] Rubinstein JH、Taybi H.大拇指和脚趾与面部异常。一种可能的精神发育迟滞综合征。Am J Dis儿童。1963;105:588–608.-公共医学

[3] Stevens CA。Rubenstein-Taybi综合征的髌骨脱位。美国医学遗传学杂志。1997;72(2):188–190. doi:10.1002/（SICI）1096-8628（19971017）72:2<188:：AID-AJMG12>3.0.订单;2-J。-内政部-公共医学

[4] Stevens CA。Rubenstein-Taybi综合征的髌骨脱位。美国医学遗传学杂志。1997;72(2):188–190. doi:10.1002/（SICI）1096-8628（19971017）72:2<188:：AID-AJMG12>3.0.订单;2-J。-内政部-公共医学

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