Amyloid-β oligomers stimulate microglia through a tyrosine kinase dependent mechanism

doi:10.1016/j.neurobiolaging.2011.10.027

.2012年10月；33(10):2247-61.

doi:10.1016/j.欧洲生物成像2011.10.027。 Epub 2011年12月1日。

淀粉样β低聚物通过酪氨酸激酶依赖机制刺激小胶质细胞

Gunjan Dhawan公司¹, 安吉拉·弗洛登, 科林·K·库姆斯

附属公司

PMID： 22133278
预防性维修识别码： PMC3294077型
内政部： 2016年10月10日/j.neurobiolaging.2011.10.027

淀粉样β低聚物通过酪氨酸激酶依赖机制刺激小胶质细胞

Gunjan Dhawan公司等。神经生物老化. 2012年10月.

.2012年10月；33（10）：2247-61。

doi:10.1016/j.neurobiolaging.2011.10.027。 Epub 2011年12月1日。

作者

Gunjan Dhawan公司¹, 安吉拉·弗洛登, 科林·K·库姆斯

附属

¹北达科他大学药理学、生理学和治疗学系，美国ND 58203大福克斯医学与健康科学学院。

PMID： 22133278
预防性维修识别码： PMC3294077型
内政部： 2016年10月10日/j.neurobiolaging.2011.10.027

摘要

阿尔茨海默病（AD）的特征是存在反应性小胶质细胞，通常与β淀粉样蛋白（Aβ）斑块沉积有关。Aβ肽（Aβ（o））的低聚物形式在小胶质细胞存在时具有神经毒性作用，并被认为可以增强AD小胶质细胞的促炎性变化。用Aβ（o）刺激的原代小鼠小胶质细胞培养物显示出蛋白磷酸酪氨酸和分泌的肿瘤坏死因子（TNF）增加-α水平被Src/Abl抑制剂达沙替尼减弱。脑室内注射Aβ（o）到C57BL6/J小鼠可刺激微胶质增生和蛋白磷酸酪氨酸水平的增加，而达沙替尼也可使其减弱。与年龄匹配的对照组相比，在人类AD大脑中验证了啮齿动物的发现，表明反应性小胶质细胞与Aβ（o）沉积相关，并且小胶质细胞蛋白磷酸酪氨酸和磷酸Src水平增加。这些数据表明，在啮齿动物模型和人类疾病中，aβ（o）通过酪氨酸激酶依赖性途径在小胶质细胞激活中发挥作用。使用选择性非受体酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼来减弱小胶质细胞依赖性的促炎变化，可能被证明是开发AD抗炎治疗方法的重要一步。

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**图1。Aβ1-42低聚物（Aβ_o个)和Aβ1-42原纤维（Aβ_（f）)**
肽(A类)Aβ_o个制备并在4或37℃下储存过夜，以评估多聚体的稳定性。增加的肽浓度用15%SDS-PAGE分离，并用抗Aβ抗体6E10进行蛋白质印迹。(B类)或者，制备Aβ_o个和Aβ_（f）在PVDF上斑点印迹（每个1μg），并与抗Aβ抗体6E10或抗低聚物抗体A11孵育。箭头表示6E10 Western blots的堆积凝胶和溶解凝胶之间的边界。

**图2。低聚物Aβ1-42刺激了小胶质细胞蛋白磷酸酪氨酸水平的增加，而酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可使其减弱**
(A类)对原发性小胶质细胞进行载体治疗（v），或用0.1μM、1μM和5μM Aβ刺激5分钟_o个用10%SDS-PAGE溶解细胞裂解产物，并用抗磷酸化Tyr（4G10）、抗pSrc、抗pLyn抗体或抗α-微管蛋白、抗Src和抗Lyn（负荷对照）抗体进行Western blot。显示了来自5个独立实验的代表性印迹。(B类)对蛋白质磷酸-酪氨酸、pSrc和pLyn水平与各自的α-微管蛋白、Src及Lyn对照进行归一化，并平均+/-SD，进行Western blot的密度分析。绘制了磷酸-酪蛋白水平的百分比倍变化曲线（*p<0.05，来自载体）。(C类)用1μM Aβ刺激原发性小胶质细胞5分钟_o个使用或不使用100pM达沙替尼（d）预处理30分钟。显示了来自3个独立实验的代表性Western blot。**（D）**对蛋白质磷酸化酪氨酸水平进行Western blot密度分析，并将其归一化为各自的α-微管蛋白对照（载体和达沙替尼的*p<0.05，Aβ+达沙替尼的**p<0.01）。

**图3。低聚物Aβ1-42刺激小胶质细胞增加促炎细胞因子TNF-α的分泌，达沙替尼可减弱这种分泌**
**（A）**用1μM和10μM Aβo刺激原发性小胶质细胞24小时，用MTT法评估细胞活力。吸光度值（560/650nm）的平均值为+/-SD。**（B）**未刺激（对照）原发性小胶质细胞，用DMSO载体治疗（v），或用1μM Aβ刺激24小时_o个或10μM Aβ_（f）存在/不存在100pM、1nM和10nM达沙替尼。从处理过的细胞中收集培养基，并通过ELISA定量TNF-α分泌的变化。分泌值平均为+/−SD（对照组和载体的*p<0.05）。(C类)去除培养基后，用处理过的细胞通过MTT还原试验评估细胞活力。吸光度值（560/650nm）的平均值为+/-SD。

**图4。脑室内输注低聚物Aβ1-42可刺激蛋白质磷酸酪氨酸和CD68免疫反应性的增加，而达沙替尼可使其减弱**
在有或无药物（500ng/kg/天）的情况下，将β低聚物（1.2mg/天）或溶媒对照物（人工脑脊液中的人类HDL）注入12个月龄雄性C57BL6/J小鼠的右侧脑室14天（n=6）。使用抗磷酸酪氨酸（4G10）和CD68抗体对大脑进行固定、切片和免疫染色。(A类)右侧海马齿状回的典型图像如图所示。箭头指示高倍插图的成像区域。免疫反应的光密度(B类)磷酸酪氨酸和(C类)从CA1区的连续切片中定量CD68。（c、v、达沙替尼（das）和Aβ+达沙替尼均p<0.001）。(D类)用抗磷酸酪氨酸、4G10（红色）和抗CD68（绿色）抗体对注射了β低聚物的小鼠大脑、12个月的APP/PS1和对照小鼠大脑进行双重免疫染色，并用DAPI进行复染。所示图像放大40倍。

**图5。Aβ寡聚物融合动物的大脑硫黄素阴性，但与抗Aβ、4G8和抗寡聚体、A11和I11抗体呈免疫反应**
**（A）**)用抗Aβ（4G8）抗体对来自野生型对照、车内融合和Aβ寡聚体融合动物（+/-）达沙替尼的大脑进行免疫染色。右侧海马齿状回的典型图像如图所示。(B类)大脑也用抗低聚物抗体A11和I11进行免疫染色，以检测注入的肽。图中显示了对照动物、车内融合动物和Aβ寡聚物融合动物的代表性图像。(C类)用硫黄素对输注载体和输注Aβ寡聚物的C57BL/6J小鼠的大脑进行染色，以确定是否存在任何原纤维，并用DAPI复染作为核染色，用苏丹黑复染以猝灭自发荧光。每组6只动物的齿状回代表性图像。(D类)用A11和OC抗体对12个月龄C57BL/6J对照小鼠和APP/PS1小鼠的大脑进行免疫染色，以观察纤维和低聚物Aβ肽沉积。显示了带有A11（棕色）和OC（蓝色）的代表性双标签。箭头表示只有A11免疫反应性（棕色），只有OC免疫反应性的（蓝色）和共定位的（黑色）。

**图6。与年龄匹配的对照组相比，AD大脑的蛋白质磷酸酪氨酸和活性磷酸Src水平升高**
AD和年龄匹配的对照组（c）颞叶裂解物（n=6）通过10%SDS-PAGE和Western blotted使用(A类)抗磷酸化-Tyr（4G10）、抗Aβ（6E10）和抗α-微管蛋白（负荷控制）抗体(C类)抗Lyn、抗磷酸-Lyn（Tyr396）、抗Src和抗磷酸-Src抗体。光学密度(B类)总磷酸化-Tyr或Aβ多聚体和(D类)将来自6个AD和年龄匹配的对照脑印迹的pLyn和pSrc归一化为各自的α-微管蛋白印迹或总蛋白水平（Lyn/Src），然后求平均值并绘制图表（+/−SD）。（*p<0.001）

**图7。AD脑小胶质细胞群体为磷酸酪氨酸免疫反应阳性，定位于Aβ低聚物**
使用抗HLA-DR抗体对AD和对照（c）颞叶切片进行免疫染色，以识别小胶质细胞、抗低聚物抗体、A11，以显示纤前肽和抗磷酸化Tyr（4G10）抗体。(A类)A11/HLA-DR双标记显示（i）AD脑内仅有A11（红色）免疫反应，（ii）双标记（黑色箭头）和（iii）仅有HLA-DR（灰色）免疫反应。(B类)还显示了HLA-DR（棕色）/磷酸化-Tyr（蓝色）的双标记。图像分别代表三个案例。

**图8。一组AD脑小胶质细胞对磷酸-Lyn和磷酸-Src呈免疫反应**
AD和对照颞叶切片用抗HLA-DR抗体鉴定小胶质细胞，抗磷酸-Lyn-396抗体鉴定活化Lyn激酶，抗磷酸-Src抗体鉴定活化Src激酶进行免疫染色。(A类)p-Src（蓝色）/HLA-DR（棕色）双标记和(C类)显示p-Lyn（灰色）/HLA-DR（红色）双标签图像。图像分别代表三个案例。AD和对照颞叶切片也使用免疫荧光标记**（B）**抗HLA-DR（绿色）和抗pSrc（红色）抗体或**（D）**抗HLA-DR（绿色）和抗pLyn（红色）抗体。

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