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.2011年11月；7（11）：e1002365。
doi:10.1371/journal.pgen.1002365。 Epub 2011年11月17日。

SUN蛋白Mps3是纺锤体极体插入核膜和核膜内稳态所必需的

詹妮弗·弗里德里希斯 1, 苏曼·戈什, 克里斯汀·斯莫耶, 斯科特·麦克罗斯基, 布兰登·D·米勒, 凯尔·J·韦弗, Kym M Delventhal公司, 杰伊·恩鲁, 布莱恩·德·斯劳特, 苏·L·贾斯珀森
附属公司

SUN蛋白Mps3是纺锤体插入核膜和核膜稳态所必需的

詹妮弗·弗里德里希斯等。 公共科学图书馆-基因. 2011年11月.

摘要

芽殖酵母纺锤极体（SPB）锚定在核膜中，从而可以同时使核质微管成核。在SPB复制过程中，新形成的SPB被插入核膜。SPB插入的机制尚不清楚，但可能涉及完整膜蛋白的作用，以调节核膜本身的变化，例如内外核膜的融合。对芽殖酵母SUN蛋白和SPB组分Mps3的功能域的分析表明，在野生型条件下，大多数区域对生长或SPB复制并不重要。然而，P-loop区域中的一个新的显性等位基因MPS3-G186K在SPB复制的多个步骤中显示缺陷，包括SPB插入，这表明先前未知的MPS3在SPB组装的这一步骤中的作用。通过电子显微镜对MPS3-G186K突变体进行表征，发现内核膜严重过度增殖，这可以通过使用化学和遗传方法改变核膜的特性来挽救。脂质分析显示，缺乏MPS3的细胞含有异常量的某些类型的极性和中性脂质，MPS3的缺失或突变可以抑制与甾醇生物合成抑制相关的生长缺陷，这表明MPS3直接影响脂质稳态。因此，我们认为Mps3通过调节核膜成分促进SPB在核膜中的插入。

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数字

图1
图1。用于SPB复制的Mps3基本区域。
（A） Mps3的示意图显示了N-末端酸性区域、跨膜结构域（TM）、P-环基序、卷曲线圈（cc）、聚谷氨酰胺（pQ）重复序列和C-末端SUN结构域。P-loop共识序列与Mps3的186–194氨基酸的比对如下所示。（B） 对每个Mps3结构域内的所示突变体进行了测试，以确定其拯救缺失的能力MPS3系统（SLJ2039）.+和−分别表示在30°C下5-氟代甲酸（5-FOA）突变体的生长和死亡。进一步分析活的等位基因，以通过流式细胞仪测定DNA含量，并测试与其他SPB突变体的遗传相互作用，包括kar1Δ17（SLJ844），cdc31-2型（SLJ894），mps2-1型（SLJ718），sfi1-3型（SLJ1558）和CDC31-16型（SLJ907）。利用共焦成像技术，将等位基因与GFP融合，以确定突变蛋白的亚细胞分布*非功能突变体在野生型Mps3存在下定位。ND，未确定**这个mps3-S190A型依赖于拷贝数：单拷贝整合子是可行的，而多拷贝整合子则是致命的，如（D）中的系列稀释试验所示。（C） 一个代表性的单平面共焦图像，显示23°C下生长的细胞中Mps3-GFP（SLJ2571）和Mps3ΔTM-GFP（SLJ4308）（绿色）以及H2B-mCherry（红色）的定位。棒材，2µm。在使用之前，通过将细胞电镀到2-氨基-5-氟苯甲酸（5-FBA）板上，将覆盖质粒从SLJ2571中去除；由于mps3ΔTM-GFP是非功能性的MPS3系统不会迷路的。（D） 不含插入物（-）的野生型SLJ2039系列稀释试验MPS3系统，或mps3-S190A型在SD-URA和5-FOA上整合为1个或2个拷贝，去除包含野生型的覆盖质粒MPS3型。在30°C下培养板2 d。（E） 野生型（SLJ001），镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型在一系列稀释试验中，测试（SLJ1797）细胞在30°C下在YPD（葡萄糖）和YPGR（半乳糖）平板上生长的能力。
图2
图2。MPS3-G186K系列由于SPB重复缺陷，表达导致有丝分裂停滞。
（A、B）镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的YEP和2%棉籽糖中培养过夜，然后添加2%半乳糖5小时以诱导表达。（A） 用流式细胞仪分析DNA含量，用相差显微镜测定出芽指数。显示大乳房细胞的百分比（n=300）。（B） 此外，使用抗α-微管蛋白（绿色）、抗γ-微管蛋白质（红色）和DAPI（蓝色）的间接免疫荧光显微镜检查纺锤体形态。每个菌株的双极性和两种单极性纺锤体的大泡状细胞百分比（n>200）显示。棒材，5µm。（C） SPB复制途径示意图显示了Spc110-GFP（绿色）和Spc42-mCherry（红色）组装的时间。（D） 使用Spc110-GFP（绿色）和Spc42-mCherry（红色）在镀锌MPS3（SLJ4859）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ4864）细胞在30°C的SC-HIS+2%半乳糖+2%棉籽糖中生长5小时。箭头指向仅包含Spc42-mCherry的未复制SPB，星号标记中的SPB片段MPS3-G186K系列，仅包含Spc110-GFP。这可能代表分层SPB，类似于在一些spc110型突变体。棒材，5µm。（E） 在两个独立的实验中，对大芽细胞中含有指定数量的Spc42-mCherry和Spc110-GFP病灶的SPB数量进行了量化（n>250）。我们还计算了在30°C的SC-HIS+2%棉籽糖+2%葡萄糖中生长5小时的SLJ4859细胞中的SPB病灶。（F–H）GAL-MPS3-G186K型在30°C的YPGR中诱导5小时后，也对（SLJ1797）突变体进行薄片EM处理，以检查SPB形态。收集15个细胞的细胞核的连续切片：（F）7个细胞核包含一个未复制的SPB，（G）4个细胞核包含SPB以及核膜细胞质表面上类似SPB前体的电子致密物质（箭头），（H）4个核包含重复和分离的SPB，形成一个短双极纺锤形。（G）中的插图显示了一个相邻的切片，其中有一个从SPB前体发出的细胞质微管（用箭头标记的位置）。（F，G）巴，100纳米。（H） 条形，200 nm。
图3
图3。核膜的过度增殖GAL-MPS3-G186K型.
镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的YPGR中诱导5小时后进行薄片EM处理。（A） Nuclei来自镀锌MPS3细胞呈现圆形或椭圆形形态（50%；n=17），类似于野生型细胞（见[55]），或（B）核形态异常（50%；n=17）。在所有原子核中镀锌MPS3细胞，仅观察到单个核膜双层。（C–F）核GAL-MPS3-G186K型所有患者（n=50）均表现出异常的核形态，包括多叶（C）和高度弯曲的突起（D）。存在多个核膜层，这通常导致（E）在包含单个核膜层的区域中聚集NPC。在其他情况下（F），观察到NPC堆积。（A–F）巴，200纳米。（G）镀锌MPS3（SLJ5097）和GAL-MPS3-G186K型将含有Nup49-GFP和Net1-mCherry的（SLJ5098）细胞在YEP+2%棉籽糖中生长到中对数期，然后将2%葡萄糖添加到一半，将2%半乳糖添加到另一半，并允许细胞在30°C下生长5 h。Nup49-GFP（绿色）和Net1-mCherry（红色）的错误定位MPS3-G186K型半乳糖与电镜观察到的异常核形态一致，但在两个突变体的细胞质中均未观察到NPC。棒材，5µm。
图4
图4。肾小管和核内膜的形成MPS3-G186K系列细胞。
EM图像来自GAL-MPS3-G186K型细胞在30°C的YPGR中生长5h，显示核内小管的形成。（A） 在左边的细胞中，小管形成的位置用一个或两个星号表示，这些区域的高倍图像显示在右边。在中央图像中，核膜的外层似乎延伸到细胞质中，包围了一个胞浆区域。一个箭头指向一个小管，形成了右图中的第三个核层。（B） 所示的细胞至少有三个有趣的膜膨胀区域，这些区域在较高放大倍数下表示和显示。在区域1中，至少有两个脂质双层包围了胞浆区域。在区域2中，细胞核内的膜膨胀不均匀。这里，细胞核内发生膜增殖，将核仁与细胞核的其余部分分隔开来。在区域3中，膜也包围着细胞质区域，但很明显，膜正在折叠回来，在膜双层内形成小管。棒材，200 nm。
图5
图5。膜特性改变抑制MPS3-G186K系列.
（A） 野生型（SLJ001），镀锌MPS3（SLJ995）和GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797）细胞在30°C的连续稀释试验中，在YPGR、YPGR+0.2%苯甲醇、YPGR+5 mM油酸和YPGR+2.5µg/ml特比萘芬平板上生长。培养板培养2天。细胞也在16°C下培养7天，23°C培养3天，33°C培养2天，以测试温度对菌落形成的影响。（B）镀锌MPS3（SLJ4963）和加仑-每加仑3克186k将含有HDEL-dsRed（红色）和Pus1-GFP（绿色）的（SLJ4965）在SC-LEU+2%棉籽糖中培养过夜，然后在30°C下添加2%葡萄糖、2%半乳糖、2%半乳糖+5 mM油酸、2%半乳糖+0.2%苄醇或2%半乳糖+1.25µg/ml特比萘芬，以观察对核形态的影响。棒材，5µm。（C–D）镀锌MPS3（SLJ4859）和加仑-每加仑3克186k（SLJ4864）细胞在SC-HIS+2%棉子糖中生长，然后按（B）处理。将含有2%半乳糖的样品移至33°C下6 h。（C）通过流式细胞仪分析DNA含量。（D） 在这些相同的细胞中，对含有指定数量的Spc42-mCherry和Spc110-GFP病灶的SPB数量进行了量化（所有样本的n>100）。
图6
图6。的抑制器MPS3-G186K系列毒性。
（A） 用pURA3-GAL-MPS3-G186K，并测试转化子在30°C条件下在SC-URA+2%半乳糖上生长3d的能力。然后通过western blotting进一步检查可能的命中，以确保与野生型对照相似，Mps3-G186K在高水平上表达。这里显示的是两个都挽救了MPS3-G186K系列并表达Mps3-G186K的野生型水平。表S2显示了在此屏幕中恢复的基因的完整列表。图中还显示了野生型菌株和加仑4Δ突变体，我们在一级筛选中分离出来，但在二级筛选中消除，因为它不表达MPS3-G186K系列。点击是使用GoSlim分析按功能组织的。在某些情况下，我们分离出一个突变，删除了重叠基因的一部分，如下括号所示。（B） 所示基因在GAL-MPS3-G186K型（SLJ1797），并在30°C的连续稀释试验中对YPD（葡萄糖）进行2天和YPGR（半乳糖）进行3天的生长测试。
图7
图7。mps3（mps3）突变体对膜特性的变化很敏感。
（A） 野生型（SLJ1779），mps-Q572LQ573L型（SLJ1783），mps3-W487A型（SLJ1785），mps3-W477A（SLJ1793），mps3Δ太阳2（SLJ1789），mps3-A540D型（SLJ1787），mps3-Y502H型（SLJ1781）和mps3-F592S（SLJ1791）细胞，或（B）野生型（SLJ001），mps3-1型（SLJ910），cdc31-2型（SLJ894），kar1Δ17（SLJ844），sfi1-3型（SLJ1558），mps2-1型（SLJ718），spc42-11型（SLJ715）和ndc1-39型（SLJ1740）细胞在YPD中生长到对数期，然后在23°C的连续稀释试验中测试其在YPD、YPD+0.2%苯甲醇和YPD+2.5µg/ml特比萘芬平板上生长的能力。in（B）细胞也在YPD+5 mM油酸上生长。
图8
图8。缺乏Mps3功能的细胞中脂质水平异常。
从5种独立生长的野生型中对数期培养物（SLJ001）中提取脂质，pom152Δ（SLJ4260）和pom152Δmps3Δ（SLJ4259）并通过ESI/MS/MS进行分析。计算每mg湿酵母细胞使用的每种类型的脂质总量，并将每类脂质的平均值与平均值的标准偏差一起制成表格。我们的脂质组学分析的完整总结见表S3。（A） 虽然总极性脂质水平没有变化，但不同类型的磷脂在pom152Δmps3Δ（白色）与野生型（黑色）或pom152Δ（灰色）。pom152Δmps3Δ细胞也显示TAG数量增加。（B） 缺少细胞POM152只含有麦角固醇和DAG水平降低。删除MPS3系统在这些细胞中，麦角固醇和DAG的水平恢复到野生型细胞中观察到的水平。（A&B）黑色星号表示野生型具有统计显著性的值，红色星号表示pom152Δ（p<0.05）。
图9
图9。缺乏细胞的膜缺陷MPS3系统可以通过以下方式抑制联邦航空局.
（A） 野生型（SLJ001），pom152Δ（SLJ4260）和pom152Δmps3Δ（SLJ5247）细胞在23℃和37℃的连续稀释试验中，在YPD和YPD+0.2%苯甲醇上生长。平板在37℃下生长2天，在23℃下生长4天。（B） 用空质粒或加仑-法阿3并在一系列稀释试验中测试其在37°C下在YPGR和YPGR+0.2%苯甲醇上生长2天的能力。
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参考文献

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