A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development

doi:10.1007/s10616-011-9407-0

.2012年3月；64（2）：187-95。

doi:10.1007/s10616-011-9407-0。 Epub 2011年11月22日。

一种快速分离功能性原代小鼠肝细胞的两步法：细胞特征和基于去唾液酸糖蛋白受体的分析

玛丽亚诺·塞弗格尼尼¹, 詹妮弗·谢尔曼, 阿尔菲卡·塞格尔, Narayananair K贾亚普拉卡什, 贾斯汀·奥宾, 王刚（Gang Wang）, 张立刚, 张国鹏, 克里斯蒂娜·尤希乌斯, 金伯乐, 凯文·菲茨杰拉德

附属公司

PMID： 22105762
预防性维修识别码：项目经理3279583
内政部： 2010年7月10日至2010年11月10日

一种快速分离功能性原代小鼠肝细胞的两步法：细胞特征和基于去唾液酸糖蛋白受体的分析

玛丽亚诺·塞弗格尼尼等。细胞技术. 2012年3月.

.2012年3月；64（2）：187-95。

doi:10.1007/s10616-011-9407-0。 Epub 2011年11月22日。

作者

附属

¹Alnylam Pharmaceuticals，300 Third St，Cambridge，MA，02142，USA，美国马萨诸塞州，msevergnini@alnyam.com。

PMID： 22105762
预防性维修识别码：项目经理3279583
内政部： 2007年10月10日/10616-011-9407-0

摘要

原代小鼠肝细胞是生物医学研究领域中评估肝细胞功能的重要工具。几种肝细胞分离方法已经发表；然而，其中许多方法需要大量处理，因此可能会损害分离细胞的活性和功能。由于利用新分离的细胞的一个优点是维持一个细胞与体内状态更具可比性的环境，因此重要的是要有稳健的方法来生产高活性、高纯度的细胞，并且其功能与体内状态相似。在这里，我们描述了一种改进的两步方法，用于快速分离和表征小鼠原代肝细胞，从而获得高产量的活细胞。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是肝细胞上最丰富的细胞表面受体之一，通过使用新开发的基于流式细胞术的配体受体结合分析显示其配体的特异性结合来监测分离肝细胞的功能。此外，利用最短培养时间的新鲜分离肝细胞成功开发了siRNA候选药物的体外筛选方法。

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数字

图1
一肝常驻细胞不同细胞标记物的mRNA水平。*转甲状腺素*(*TTR公司*)，*CD45型*,*胶原蛋白IaI*和*第2级*用分支DNA法（bDNA）测量新鲜分离肝细胞中的mRNA水平。非肝细胞标记物相对于看家基因GAPDH的mRNA百分比为1.6%*CD45型*，5.7%*胶原蛋白IaI*和5.7%*第2级*.误差线表示标准偏差。b条流式细胞术测定肝细胞数量。前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）用于根据细胞大小分离肝细胞和非肝细胞。这个*圆点图*显示的是活细胞群的门控

图2
电镀后的肝细胞形态。在电镀后5、24、48、72、96和120小时拍摄的电镀小鼠肝细胞的典型相控显微镜照片（40倍放大）。*比例尺*代表35μm

图3
*ASGR1标准*-2镀膜肝细胞的mRNA下调。*ASGR1和ASGR2*使用分支DNA方法和小鼠ASGR1和ASGR2特异探针，相对于看家基因GAPDH定量mRNA水平。在细胞板形成后5、24、48、72和96小时收集细胞裂解物，并与新鲜分离肝细胞产生的裂解物进行比较。*误差线*表示标准偏差

图4
培养肝细胞中去唾液酸糖蛋白受体（ASGR1）主要亚单位的蛋白质水平。Western blot显示24、48、72、96、120、144和168小时后收集的肝细胞裂解物中ASGR1的水平。β-肌动蛋白用作负荷对照，HepG2细胞用作ASGR1表达的阴性对照

图5
培养肝细胞中CYP2A13蛋白水平。Western blot显示培养5、24、48、72、96和120小时后收集的裂解液中的细胞色素P450水平。β-肌动蛋白被用作负荷对照，HeLa细胞提取物被用作低CYP2A13表达的对照

图6
一显示30 nM GalNAc孵育肝细胞荧光强度的直方图₂(绿色)，30 nM GalNAc_三(蓝色)和空白(红色).b条GalNAc配体结合分析。将新鲜分离的悬浮肝细胞与30、15、7.5、3.8、1.9和0.9 nM生物素化GalNAc孵育2 h₂和GalNAc_三在与链霉亲和素Alexa647孵育后，通过流式细胞仪测量中值荧光强度（MFI）。使用非线性回归曲线拟合模型（Prism 4.0软件）计算Kd值（nM）

图7
*载脂蛋白B*GalNAc-siApoB偶联物在原代小鼠肝细胞中沉默mRNA。将悬浮细胞与5、0.83、0.14、0.02、0.003、0.0006和0.0001μM GalNAc-siApoB与双或三天线GalNAc配体结合培养4 h。b进行DNA分析以监测*载脂蛋白B*mRNA相对于*GAPDH公司*mRNA作为siRNA结合物浓度的函数。IC50曲线由剂量-反应-单点拟合模型（Microsoft Excel fit）确定。IC50值以nM表示

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1. Ashwell G，Harford T.肝脏中的碳水化合物特异性受体。生物化学年度收益。1982;51:531–554. doi:10.1146/annurev.bi.51.070182.002531。-内政部-公共医学
1. Bhandari RN、Riccalton LA、Lewis AL、Fry JR、Hammond AH、Tendler SJ、Shakesheff KM。肝组织工程：共培养系统在改善肝细胞功能和生存能力中的作用。组织工程2001；7:345–357. doi:10.1089/10763270152044206。-内政部-公共医学
1. Biessen EA，Beuting DM，Roelen HC，Marel GA，Boom JH，Berkel TJ。合成对肝脏去唾液酸糖蛋白受体具有高亲和力的簇状半乳糖苷。医学化学杂志。1995;38:1538–1546. doi:10.1021/jm00009a014。-内政部-公共医学
1. Braun JR、Willnow TE、Ishibashi S、Ashwell G、Herz J。无唾液酸糖蛋白受体的主要亚单位在缺乏次要受体亚单位的小鼠肝细胞表面表达。生物化学杂志。1996;271:21160–21166. doi:10.1074/jbc.271.35.21160。-内政部-公共医学
1. Connolly DT、Townsend RR、Kawaguchi K、Bell WR、Lee YC。兔肝细胞对簇合糖苷的结合和内吞作用。短路路径不会导致降解的证据。生物化学杂志。1982;257:939–945.-公共医学

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[1] Ashwell G，Harford T.肝脏中的碳水化合物特异性受体。生物化学年度收益。1982;51:531–554. doi:10.1146/annurev.bi.51.070182.002531。-内政部-公共医学

[2] Ashwell G，Harford T.肝脏中的碳水化合物特异性受体。生物化学年度收益。1982;51:531–554. doi:10.1146/annurev.bi.51.070182.002531。-内政部-公共医学

[3] Bhandari RN、Riccalton LA、Lewis AL、Fry JR、Hammond AH、Tendler SJ、Shakesheff KM。肝组织工程：共培养系统在改善肝细胞功能和生存能力中的作用。组织工程2001；7:345–357. doi:10.1089/10763270152044206。-内政部-公共医学

[4] Bhandari RN、Riccalton LA、Lewis AL、Fry JR、Hammond AH、Tendler SJ、Shakesheff KM。肝组织工程：共培养系统在改善肝细胞功能和生存能力中的作用。组织工程2001；7:345–357. doi:10.1089/10763270152044206。-内政部-公共医学

[5] Biessen EA，Beuting DM，Roelen HC，Marel GA，Boom JH，Berkel TJ。合成对肝脏去唾液酸糖蛋白受体具有高亲和力的簇状半乳糖苷。医学化学杂志。1995;38:1538–1546. doi:10.1021/jm00009a014。-内政部-公共医学

[6] Biessen EA，Beuting DM，Roelen HC，Marel GA，Boom JH，Berkel TJ。合成对肝脏去唾液酸糖蛋白受体具有高亲和力的簇状半乳糖苷。医学化学杂志。1995;38:1538–1546. doi:10.1021/jm00009a014。-内政部-公共医学

[7] Braun JR、Willnow TE、Ishibashi S、Ashwell G、Herz J。无唾液酸糖蛋白受体的主要亚单位在缺乏次要受体亚单位的小鼠肝细胞表面表达。生物化学杂志。1996;271:21160–21166. doi:10.1074/jbc.271.35.21160。-内政部-公共医学

[8] Braun JR、Willnow TE、Ishibashi S、Ashwell G、Herz J。无唾液酸糖蛋白受体的主要亚单位在缺乏次要受体亚单位的小鼠肝细胞表面表达。生物化学杂志。1996;271:21160–21166. doi:10.1074/jbc.271.35.21160。-内政部-公共医学

[9] Connolly DT、Townsend RR、Kawaguchi K、Bell WR、Lee YC。兔肝细胞对簇合糖苷的结合和内吞作用。短路路径不会导致降解的证据。生物化学杂志。1982;257:939–945.-公共医学

[10] Connolly DT、Townsend RR、Kawaguchi K、Bell WR、Lee YC。兔肝细胞对簇合糖苷的结合和内吞作用。短路路径不会导致降解的证据。生物化学杂志。1982;257:939–945.-公共医学

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