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.2011年12月；121(12):4850-60.
doi:10.1172/JCI59261。 Epub 2011年11月21日。

成熟肝细胞在小鼠肝脏稳态和再生中的命运追踪

亚恩·马拉托 1, 赛义德·纳克维, 妮娜·舒尔曼, 雷蒙德·吴, 王小龙（Bruce Wang）, 琼·扎普, 马克·A·凯, 德克·格里姆, 霍尔格·威伦格林
附属公司

成熟肝细胞在小鼠肝脏稳态和再生中的命运追踪

亚恩·马拉托等。 临床研究杂志. 2011年12月.

摘要

最近的证据与主流观点相矛盾，即成人肝脏的稳态和再生是由谱系限制性肝细胞和胆道上皮细胞的自我复制介导的。这些新数据表明，肝前体细胞在慢性肝损伤中并不仅仅起到备份系统的作用；相反，它们在急性损伤后也产生肝细胞，实际上是正常肝细胞周转期间新肝细胞的主要来源。此外，其他证据表明肝细胞能够进行谱系转换，在胆道损伤期间充当胆道上皮细胞的前体。为了验证这些概念，我们利用腺相关病毒载体，在成年Rosa26报告小鼠的所有肝细胞中，基于Cre重组酶的定时特异表达和标记基因的激活，建立了一个肝细胞命运追踪模型。我们发现，新形成的肝细胞来源于正常肝脏中原有的肝细胞，肝祖细胞对急性肝细胞再生的贡献最小。此外，我们没有发现胆道损伤导致肝细胞转化为胆道上皮细胞的证据。因此，这些结果恢复了先前盛行的肝脏稳态和再生模式。此外，我们的新载体系统将是一个有价值的工具，可以定时、高效、特异地从肝细胞中的floxed序列中循环出来。

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数字

图1
图1。注射AAV8-Ttr-Cre的成年R26R-EYFP和R26R小鼠的所有肝细胞中的快速标记基因激活。
(A类)AAV8-Ttr-Cre载体滴定的斑点杂交和qPCR结果。滴度约为4×1012斑点杂交和qPCR分析中的病毒基因组/ml（补充图1，A和B）。数据代表平均值±SEM(B类)剂量发现策略。在成年R26R-EYFP小鼠尾静脉注射不同剂量的AAV8-Ttr-Cre后5天，通过免疫染色对其肝脏进行EYFP-分析。(C类) 1.5 × 1011病毒基因组不足以激活所有肝细胞中的EYFP表达（红色）。4 × 1011病毒基因组激活了所有肝细胞中的EYFP表达。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(D类)注射4×10后48小时雄性和雌性R26R小鼠肝脏的X-gal染色11病毒基因组显示β-gal在所有肝细胞中表达（蓝色）。每个实验分析3只小鼠的15个肝脏切片。原始放大倍数，×200。
图2
图2。AAV8-Ttr-Cre无肝毒性。
(A类)毒性试验。在注射4×10的R26R-EYFP成年小鼠后3天和5天，对其血液和肝脏进行分析11AAV8-Ttr-Cre、AAV8-Ttr-control或PBS的病毒基因组。(B类)注射病毒和PBS后5天，H&E染色显示肝脏组织学正常。原始放大倍数，×100。每组分析4只小鼠的12个肝脏切片。(C类和D类)正常的ALT和AST转氨酶、直接胆红素（DBIL）和白蛋白血水平表明肝细胞未受损(C类)功能正常(D类)AAV8-Ttr-Cre注射小鼠。(E类)qRT-PCR分析表明炎症相关基因Tnfa公司和伊尔6未在AAV8-Ttr-Cre注射小鼠的肝脏中诱导。每组分析4只小鼠。数据表示平均值±SEM。
图3
图3。注射AAV8 Ttr Cre的成年R26R-EYFP小鼠中EYFP表达的肝细胞特异性激活。
注射4×10后5天，对肝脏进行EYFP（红色）和细胞类型特异性标记物（绿色）联合免疫11AAV8-Ttr-Cre病毒基因组。双阳性细胞呈黄色。(A类)所有MUP阳性细胞也均为EYFP阳性，这证实AAV8-Ttr-Cre在成年小鼠的所有肝细胞中循环出漂浮序列。(B类)在Alb-Cre、R26R-EYFP对照小鼠中，不仅所有肝细胞，而且所有CK19阳性胆汁细胞都表达EYFP。(C类)CK19阳性的所有细胞均为EYFP阴性，这表明AAV8-Ttr-Cre不会在胆道上皮细胞和肝祖细胞中循环出漂浮序列。(D类–F类)F4/80的所有单元格均为阳性(D类)，结蛋白/α-SMA/GFAP(E类)，或isolectin B4（“凝集素”）(F类)EYFP阴性，这表明AAV8-Ttr-Cre在肝巨噬细胞、星状细胞或窦状、门静脉和中央静脉内皮细胞中不会循环出漂浮序列。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数，×100，插图×200(A类,C类、和E类); ×200，嵌入×400(B类,D类、和F类). 每个实验分析4只小鼠的20个肝脏切片。
图4
图4。肝内稳态中的肝细胞命运追踪。
(A类)注射4×10后12周和24周，对成年R26R-EYFP小鼠的肝脏进行分析11AAV8-Ttr-Cre病毒基因组。(B类)H&E染色显示肝脏组织学正常。(C类和D类)EYFP（红色）和CK19（绿色）的联合免疫染色显示12周时肝细胞板和胆管正常(C类)和24周(D类)AAV8-Ttr-Cre注入后。在两个时间点均未出现肝细胞EYFP阴性。(E类和F类)EYFP（红色）和MUP（绿色）的联合免疫染色证实所有肝细胞在12周后都表达EYFP(E类)和24周(F类)AAV8-Ttr-Cre注入后。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数×100，插图×200。每个实验分析3只小鼠的15个肝脏切片。
图5
图5。急性四氯化碳中毒后肝细胞命运追踪。
(A类)成年R26R-EYFP小鼠注射4×1011AAV8-Ttr-Cre病毒基因组，7天后接受单剂量CCl4。在四氯化碳中毒后2天对肝脏进行分析。(B类)H&E染色显示中央周围肝细胞坏死。(C类)EYFP（红色）和CK19（绿色）的联合免疫染色证实肝细胞在中央周围区域丢失，而包括胆管在内的门脉周围区域则正常。(D类)EYFP（红色）和MUP（绿色）的联合免疫染色无法检测门周区域出现的EYFP阴性肝细胞。中央周围坏死肝细胞呈弱MUP阳性（补充图5C）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数×100，插图×200。对4只小鼠的20个肝脏切片进行分析。
图6
图6。慢性四氯化碳中毒后肝细胞命运追踪。
(A类)成年R26R-EYFP小鼠注射4×1011AAV8-Ttr-Cre的病毒基因组，1周后开始，连续6周接受双周剂量的CCl4。在最后一次CCl4剂量后3天，对肝脏进行分析。(B类)H&E染色显示肝脏重塑，包括门脉周围区域之间的桥接。(C类)EYFP（红色）和CK19（绿色）的联合免疫染色显示，在CK19阳性细胞附近有一簇类似肝细胞的EYFP-阴性细胞（白色箭头）。(D类)EYFP（红色）和MUP（绿色）的联合免疫染色证实存在EYFP-阴性、MUP阳性肝细胞簇（白色箭头）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数×100，插图×200。对3只小鼠的15个肝脏切片进行分析。
图7
图7。2/3 PH后肝细胞命运追踪。
(A类)成年R26R-EYFP小鼠注射4×1011AAV8-Ttr-Cre病毒基因组，7天后接受2/3 PH。在2/3 PH后21天对肝脏进行分析。以2/3PH切除的肝叶作为对照。(B类)H&E染色显示2/3 PH后21天肝组织学恢复正常(C类和D类)EYFP（红色）和CK19（绿色）的联合免疫染色显示，所有肝细胞在2/3 PH之前都表达EYFP(C类)但在2/3 PH后，门脉周围区域出现类似肝细胞的EYFP阴性细胞簇(D类，白色箭头）。(E类)EYFP（红色）和MUP（绿色）的联合免疫染色证实存在单细胞和成簇的EYFP-阴性、MUP阳性肝细胞（白色箭头）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数×100，插图×200。对4只小鼠的20个肝脏切片进行分析。
图8
图8。BDL后肝细胞命运追踪。
(A类)成年R26R-EYFP小鼠注射4×1011AAV8 Ttr Cre的病毒基因组，并在7天后进行BDL。BDL后10天对肝脏进行分析。(B类)H&E染色显示广泛的导管反应。(C类)EYFP（红色）和CK19（绿色）的联合免疫染色显示无双阳性细胞。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数×100，插图×200。对5只小鼠的25个肝脏切片进行分析。
图9
图9。DDC喂养后肝细胞命运追踪。
(A类)成年R26R-EYFP小鼠注射4×10111周后开始AAV8-Ttr-Cre和DDC喂食的病毒基因组。喂食DDC 3或8周后对肝脏进行分析。(B类)H&E染色显示导管反应随着DDC喂食时间的延长而扩张。(C类和D类)EYFP（红色）和CK19（绿色）的联合免疫染色显示3天后无双阳性细胞(C类)或8(D类)DDC喂养周。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数×100，插图×200。每个实验分析4只小鼠的20个肝脏切片。
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中的注释

  • 关于肝脏的起源。
    Friedman JR，Kaestner KH。 Friedman JR等人。 临床投资杂志。2011年12月；121(12):4630-3. doi:10.11172/JCI59652。Epub 2011年11月21日。 临床投资杂志。2011 PMID：22105167 免费PMC文章。
  • 肝脏上皮细胞的表型保真度（或不保真度？）。
    Michalopoulos GK公司。 Michalopoulos GK公司。 肝病学。2012年6月；55(6):2024-7. doi:10.1002/hep.25703。 肝病学。2012 PMID：22407729 免费PMC文章。

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