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.2011年11月29日；108(48):19204-9.
doi:10.1073/pnas.1108977108。 Epub 2011年11月11日。

β-连环蛋白/TCF4复合物诱导上皮-间充质转化（EMT）激活剂ZEB1调节肿瘤侵袭性

埃斯特·桑切兹·蒂洛 1, Oriol de Barrios公司, 劳拉·西尔斯, 米里亚姆·库特雷卡斯, 安东尼·卡斯特尔斯, 安东尼奥·波斯蒂戈
附属公司

β-catenin/TCF4复合物诱导上皮-间充质转化（EMT）激活物ZEB1调节肿瘤侵袭性

Ester Sánchez Tilló等。 美国国家科学院程序. .

摘要

在大多数癌症中，恶性细胞侵入周围组织涉及到作为上皮-间充质转化（EMT）一部分的分子重编程。大多数结直肠癌（CRC）中APC基因的突变导致癌蛋白β-catenin的核移位，与T细胞和淋巴增强因子（TCF-LEF）结合后触发EMT和侵袭前基因表达谱。EMT的关键诱导物是ZEB1转录因子，其表达促进肿瘤的发生和转移。作为上皮表型的抑制剂，ZEB1从不存在于正常结肠上皮或癌细胞肿瘤中心的β-catenin保持膜性。我们在这里显示，ZEB1由人类患者（家族性腺瘤性息肉病）和小鼠模型（APC（Min/+））肠道肿瘤中的上皮细胞表达，APC的种系突变导致β-catenin的核聚积。然而，ZEB1在携带野生型APC的遗传型CRC的上皮细胞中不表达，β-catenin被排除在细胞核之外（Lynch综合征）。我们发现β-catenin/TCF4直接与ZEB1启动子结合并激活其转录。在APC突变的CRC细胞中，β-catenin和TCF4的敲除抑制内源性ZEB1，而在APC-野生型CRC细胞中将β-catentin强行转移到细胞核中则诱导ZEB1的从头表达。β-catenin/TCF4上调MT1-MMP和LAMC2与结直肠癌的侵袭性有关，我们在这里表明，在APC突变的原发性大肠肿瘤中，这两种蛋白都被ZEB1激活，ZEB1与之共存。这些结果将ZEB1设定为EMT和肿瘤进展中β-catenin/TCF4信号的效应器。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
ZEB1与核β-连环蛋白共存。(A类)散发性CRC、FAP结直肠腺瘤和癌以及Lynch CRC的肿瘤前沿β-连环蛋白（红色，克隆14或Ab6302）和ZEB1（绿色，H-102或E-20）的免疫荧光染色。图中显示了一个典型的合并图片（黄色单元格表示共定位）。β-catenin、ZEB1和DAPI的单一染色如所示图S1A类并放大图S1B类.比例尺，25μm。(B类)正常肠粘膜和4个月龄野生型APC（放大400倍）和APC腺瘤中β-catenin（克隆14）和ZEB1（H-102）的免疫组织化学染色最小值/+（200×）只小鼠。
图2。
图2。
β-catenin/TCF4激活ZEB1转录。(A类)用0.5μg人ZEB1启动子加上1μg空表达载体（“−”）或等量的TCF4或TCF4表达载体转染SW480和HCT116细胞第1-30天(“+”). 按照中所述进行转录分析SI讨论。将带有空载体的两个细胞系中的相对荧光素酶活性（RLU）设置为一个共同值进行比较。至于TOPFLASH记者(图S2C类)在HTC116细胞中，ZEB1启动子的基础活性较低。(B类)用ZEB1启动子和1μg空表达载体或等量TCF4、β-catenin和/或β-连环蛋白沙特阿拉伯. (C类)与中相同B类但在HCT116细胞中。(D类)TCF4和β-catenin与ZEB1启动子结合。用抗TCF4抗体、β-catenin抗体及其各自的对照IgG和无抗体的SW480细胞的ChIP分析中免疫沉淀的ZEB1和GAPDH启动子片段的实时PCR定量（qRT-PCR）。扩增的ZEB启动子区域包含-578和-161处的TCF结合位点。值表示相对于输入的相对绑定。(E类)内源性β-catenin和TCF4调节ZEB1转录。如中所示A类，用ZEB1启动子和100 nM针对β-连环蛋白（siβcat）、TCF4（siTCF4）或对照siRNA（siCtl）的siRNA转染SW480细胞。(F类)如中所示B类将ZEB1启动子和1μg空载体或等量TCF4、β-catenin和TLE1的不同组合转染SW480细胞。
图3。
图3。
β-catenin/TCF4对ZEB1的内源性调节。(A类)内源性β-catenin和TCF4调节内源性ZEB1 mRNA。SW480细胞转染50–100 nM的对照siRNA或针对ZEB1、β-catentin和TCF的特异siRNA。通过qRT-PCR测定GAPDH的相对mRNA水平。(B类)内源性β-catenin和TCF4调节内源性ZEB1蛋白。用对照物瞬时转染SW480细胞，并对ZEB1（H-102）、β-连环蛋白（克隆14）、TCF4（H-125）和α-微管蛋白（B5-1-2）的特异性siRNA和细胞裂解物进行免疫印迹，以控制负载。(C类)β-catenin的核积累诱导内源性ZEB1。(左侧)用0.5μg ZEB1启动子转染HTC116细胞，48小时后，用10ng/mL LMB处理不同时间，然后处理细胞裂解物进行萤光素酶活性定量（见支持信息). (居中)用10 ng/mL LMB处理HCT116细胞不同时期后，通过qRT-PCR评估ZEB1 mRNA水平。(赖特)用10 ng/mL LMB处理HCT116细胞不同时间后进行裂解，并用ZEB1（H-102）和α-微管蛋白（B5-1-2）Abs通过Western blot测定蛋白质水平。
图4。
图4。
ZEB1对APC突变的CRC细胞中MT1-MMP和LAMC2的调节。(A类)ZEB1激活CRC细胞中MT1–MMP的表达。(左侧)ZEB1激活MT1–MMP转录。用0.8μg人MT1–MMP启动子和1.0μg空表达载体或等量的ZEB1表达载体转染SW480细胞。(居中)ZEB1激活内源性MT1–MMP mRNA。用siRNA对照或ZEB1、β-连环蛋白和TCF4的特异性siRNA转染的SW480细胞通过qRT-PCR评估MT1–MMP mRNA的相对水平。(赖特)ZEB1调节内源性MT1–MMP蛋白。用50 nM的ZEB1或对照siRNA瞬时转染SW480细胞。用免疫印迹法检测MT1-MMP（LEM2/15.8）、ZEB1（H-102）和α-微管蛋白（B5-1-2）的蛋白表达。(B类)ZEB1激活CRC细胞中LAMC2的表达。(左侧)ZEB1激活LAMC2转录。与中相同A类，但同时使用野生型LAMC2启动子（LAMC2）或两个ZEB1结合位点发生突变的突变型（LAMC2-MUT）(居中)ZEB1激活内源性LAMC2 mRNA。与A类但对于LAMC2 mRNA(赖特)ZEB1调节内源性LAMC2蛋白。与中相同A类，但使用了LAMC2（D4B5）抗体。
图5。
图5。
FAP腺瘤和癌中ZEB1与MT1–MMP和LAMC2相关。(A类)对FAP腺瘤、癌和Lynch癌进行MT1-MMP（红色）和ZEB1（绿色）免疫染色。显示了具有代表性的合并图片。MT1–MMP、ZEB1和DAPI的单一染色如所示图S5A类. (B类)与中的相同A类，但适用于LAMC2（红色）和ZEB1（绿色）。单个染色捕获如所示图S5C类.比例尺，25μm。
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