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.2011年11月1日；25(21):2248-53.
doi:10.1101/gad.173922.111。

通过多能性状态的重新编程使衰老和百岁的人类细胞恢复活力

劳雷·拉帕斯特 1, 奥利维尔·米尔哈韦, 亚历山大·普里厄尔, 艾米莉·贝斯纳德, 艾米莉·巴伯德, 纳菲萨·阿伊特·哈马, 朱莉娅·莱斯奇克, 弗兰克·佩莱斯特, 珍妮·马里·拉米雷斯, 约翰·德沃斯, 西尔万·莱曼, Jean-Marc Lemaitre牛仔裤
附属公司

通过多能性状态的重新编程使衰老和百岁的人类细胞恢复活力

劳雷·拉帕斯特等。 基因开发. .

摘要

将体细胞直接重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）为获得患者特异性干细胞提供了一个独特的机会，该干细胞在组织替代疗法中具有潜在的应用前景，并且无需考虑人类胚胎干细胞（hESCs）的伦理问题。然而，导致衰老和寿命受限的细胞衰老被描述为iPSC衍生的障碍。在这里，我们使用优化的方案证明，细胞衰老不限于重新编程，与年龄相关的细胞生理学是可逆的。因此，我们表明，我们从衰老细胞和百岁细胞中生成的iPSCs已经重置了端粒大小、基因表达谱、氧化应激和线粒体代谢，并且与人胚胎干细胞没有区别。最后，我们证明衰老和百年生衍生的多能干细胞能够再分化为完全再生的细胞。这些结果为iPSC技术提供了新的见解，并为老年患者的再生医学铺平了道路。

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数字

图1。
图1。
在增殖和衰老的74岁衍生细胞中诱导多能性。(A类，面板1)通过六种因子间接免疫荧光H3K9me3（红色）和Hoechst（蓝色）检测增殖细胞（74P）、衰老细胞（74S）和转导衰老细胞（74 S-inf）中的SAHF。转导7天后，未检测到SAHF。（面板2)转导18天后，观察感染74S细胞的增殖（74S-inf）。在第40天左右，观察到不同的菌落。显示了具有代表性的相位对比图像。(B类)表面标记TRA-1-60和SSEA-4对来源于74S和74P岁细胞（三个独立克隆）的iPSCs集落的免疫检测。(C类)定量RT-PCR检测74P和74S及其亲代成纤维细胞iPSCs内源性多潜能因子的表达水平。使用H1和H9 hESCs和iPSC TH 4作为对照。转录水平标准化为GAPDH表达。误差线表示重复实验的标准偏差。(D类)亚硫酸氢盐序列分析华侨城4号和NANOG公司与亲代成纤维细胞相比，74P和74S的iPSCs的启动子区域显示去甲基化，如H9 hESCs。给定扩增子的每一列圆圈代表该区域一个克隆中CpG二核苷酸的甲基化状态。开环是非甲基化的CpG，闭环是甲基化的。这个左边每列的数字表示CpG相对于转录起始位点的定位。(E类)iPSCs的体外分化实验揭示了其生成所有三个初级生殖细胞层的细胞衍生物的潜力。分别对内胚层、外胚层和中胚层特异的SMA、MAP2和FOXA2标记进行免疫检测。细胞核被Hoechst（蓝色）染色。显示了三个独立的克隆。
图2。
图2。
百年生衍生细胞的多能性诱导。(A类)定量RT-PCR检测所示供体成纤维细胞和iPSC系内源性多潜能因子的表达水平。以H1和H9 hESCs以及iPSC IMR90 TH Cl4细胞作为对照。转录水平标准化为GAPDH表达。误差条表示重复实验的标准偏差。(B类)衍生iPSCs集落上多能干细胞表面标记TRA-1-60和SSEA-4的免疫检测。(C类)通过分别针对内胚层、外胚层和中胚层的SMA、MAP2和FOXA2标记物的免疫检测，揭示了三个初级生殖细胞层中iPSCs的体外分化能力。核染色采用Hoechst标记（蓝色）。
图3。
图3。
衰老细胞衍生iPSCs中衰老标记物的消失。(A类)p21的减少CIP1级和p16INK4A（墨水）Western blotting分析74P和74S细胞生成的iPSCs中的蛋白质水平，并与亲代成纤维细胞和H9 hESCs进行比较。β-肌动蛋白作为负荷对照。(B类)74P和74S细胞产生iPSC克隆的TRF分析及其与亲代成纤维细胞和H9 hESCs的比较；TRF长度单位为千基（kb）。(C类)成纤维细胞、iPSC、hESCs、74岁和96岁成纤维细胞及其相应的iPSC中全局基因表达谱的非监督分级聚类。(D类)通过FACS测量JC-1红/绿荧光比率分析74P和74S来源的iPSCs线粒体功能的重编程，以及与H1 hESCs相比96岁细胞的线粒体功能。红色荧光表示正常的膜电位，绿色荧光表示膜去极化。下降的比率衡量线粒体功能障碍的程度。实验一式三份（标准偏差为±SD）。
图4。
图4。
用六因子重编程策略从衰老和老化的成纤维细胞生成的iPSC中再分化成纤维细胞的再生特征。(A类)对iPSCs（PD 90）再分化的增殖（PD 10）和复制性衰老（PD 60–63）成纤维细胞进行SA-β-gal染色。阳性细胞百分比显示在插入。实验一式三份（标准偏差为±SD）。(B类)p21的恢复CIP1级和第16页INK4A（墨水）在复制性衰老过程中，iPSC-derived成纤维细胞中的蛋白表达被触发。Western blot分析使用β-肌动蛋白作为负荷控制。(C类)与74P-、74S-和96岁的亲代成纤维细胞、出生后成纤维细胞和从H1-hESCs分化的胚胎成纤维细胞相比，iPSCs基因表达谱的非监督分层聚类可重新分化为成纤维细胞。
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