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.2011年10月；7（10）：e1002316。
doi:10.1371/journal.ppat.1002316。 Epub 2011年10月27日。

组蛋白脱乙酰酶8是中心体凝集和甲型流感病毒进入所必需的

山内洋平 1, 海特姆·布卡里, 英德拉尼尔·班纳吉, 伊沃·F·斯巴尔扎里尼, 彼得·霍瓦思, 阿里·海伦纽斯
附属公司

组蛋白脱乙酰酶8是中心体凝集和甲型流感病毒进入所必需的

山内洋平等。 公共科学图书馆病理学. 2011年10月.

摘要

甲型流感病毒（IAV）通过内吞作用进入宿主细胞，然后通过酸激活从晚期内体（LE）渗透。通过siRNA沉默，我们发现组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8），一种细胞质酶，有效地促进了IAV生产性进入组织培养细胞，而HDAC1抑制了IAV的生产性进入。HDAC8增强了进入病毒的内吞、酸化和渗透。相反，HDAC1抑制酸化和渗透。这些效应与微管系统的组织结构发生了巨大变化有关，因此，LEs和溶酶体（LYs）的行为发生了变化。HDAC8的耗尽导致中心体相关微管的丢失和LEs定向向心运动的丢失，将LE/LYs分散到细胞外周。对于HDAC1，情况正好相反。为了解释这些变化，中心体内聚成为关键因素。HDAC8的耗竭导致中心体分裂，这也可以通过耗竭一种中心连接蛋白，即根素来诱导。在这两种情况下，IAV感染被抑制。HDAC1缺失减少中心体分裂，增加感染。中心体之间的距离越长，感染水平越低。HDAC8缺失还可以抑制Uukuniemi病毒（一种布尼亚病毒）的感染，这表明晚期穿透包膜病毒的共同需求。结果表明，I类HDAC是微管组织、中心体功能、内体成熟以及IAV和其他晚期穿透病毒感染的强大调节器。

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数字

图1
图1。HDAC8是IAV X31感染、内吞作用和HA酸化所必需的。
（A） IAV X31感染检测。在缺失HDAC1、3、8、vATPase亚单位ATP6V1B2和CAS（CSE1L）的A549细胞中定量感染72 h。细胞在TCID50=7.5×10时感染X31三/感染培养基（D-MEM，50 mM HEPES，pH 6.8，0.2%BSA）中的ml。固定后，细胞在渗透缓冲液（0.1%皂苷，PBS中1%BSA）中培养，并用单克隆抗体HB-65间接IFA染色NP。细胞核用Hoechst染色。通过自动显微镜获取图像，并使用基于MATLAB的感染评分程序（the MathWorks，Inc.）量化表达NP的细胞分数，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。20%的对照细胞在这些条件下被感染。（B–F）IAV X31进入分析。A549细胞缺乏HDAC1、3、8，以及ATP6V1B2或CAS（CSE1L）。在所有实验中，细胞首先与TCID50=2.4×10结合6/ml病毒在4°C下保存1小时。（B） 结合分析。结合后，清洗细胞并固定。结合在细胞表面的病毒颗粒用抗X31 Pinda抗体间接IFA染色。（C） 细胞内吞试验。结合后，清洗细胞并加热至37°C，30分钟后固定。用Pinda抗体阻断细胞外血凝素（HA）抗原后，用HA1特异性单克隆抗体间接IFA染色内吞病毒颗粒。为了阻止动态素依赖性内吞，在内吞试验之前和期间，用120µM动态素对细胞进行预处理。（D） HA酸化试验。结合后，将细胞清洗和/或加热至37°C，并在30、60、120、210和300分钟后固定。用抗A1单克隆抗体（一种识别HA酸诱导构象的单克隆抗体）间接IFA对酸化的HA进行染色。将巴非霉素A添加到对照细胞中以阻止内体酸化。（E） 计算5小时内HA的累积酸化，并将其归一化为对照细胞。（F） vRNP核导入分析。结合后，清洗细胞，在1 mM环己酰亚胺存在下加热至37°C，并固定5 h。传入NP（vRNP）用HB-65间接IFA染色。将巴非霉素A添加到对照细胞中以阻止内体酸化。（G） 酸介导的内吞旁路。细胞与TCID50=1×10结合6/ml病毒在4°C下培养1小时，清洗，然后在37°C的低pH介质（pH 5.0）中培养2.5分钟，以诱导病毒包膜和质膜融合，从而将vRNP直接释放到胞浆中。细胞在缓冲至pH 7.4且含有20 mM NH的培养基中再培养12 h4Cl阻止内体酸化。感染量按感染试验进行量化。所有数据均表示为平均值±SEM。
图2
图2。HDAC8缺失导致LE/Lys扩散。
（A） 高尔基复合体（giantin，红色）和LE/LY（LAMP1，绿色）在对照（All*Neg）、HDAC8缺失（si HDAC8）和HDAC1缺失（si HDAC1）A549细胞中的定位。细胞被固定并通过间接IFA用抗giantin和抗LAMP1抗体染色。细胞核用DRAQ5染色。（B） LE/LY扩散指数的测定。A549细胞缺乏HDAC1、8、KIFC1、KIFC2和动力蛋白亚基ACTR10和DCTN2。细胞固定后用抗LAMP1抗体间接IFA染色。肌动蛋白用指骨肽染色，DNA用Hoechst染色。使用20倍物镜自动采集图像并进行分析，以得出LAMP1阳性内体的分散指数。对照（All*Neg）细胞的分散指数设置为零，用30µM诺可达唑处理1小时（All*Neg+nocode）的细胞的分散指数设置为1.0。数据表示为平均值±SEM，KIFC1、KIFC2、ACTR10除外，其中显示了4种不同siRNA的平均值（2个独立实验）。（C） EGF降解。A549细胞耗尽HDAC1，8在96周的基质板中，耗尽48小时后，在无血清培养基中饥饿24小时。EGF-AF647（200 ng/ml）在冰上结合30分钟。清洗后，将细胞在含血清的培养基中加热至37°C，以使EGF内化。在加温后15分钟和4小时，在酸性缓冲液（0.1 M甘氨酸，pH 3）中在冰上清洗细胞2分钟，以去除细胞外EGF，清洗并固定，并用Hoechst染色。使用10倍物镜自动成像EGF和细胞核。使用ImageJ量化EGF信号强度，并显示每个核在4小时（与15分钟相比）时EGF降解的百分比。通过Student t检验（*）评估统计显著性，p<0.05。数据表示为平均值±SEM。（D）转铁蛋白（TF）摄取。12孔板中的A549细胞缺乏HDAC1，8。在耗尽的第三天，细胞在无血清培养基中饥饿4小时，然后将TF-AF488（5µg/ml）结合在冰上30分钟。清洗后，将细胞在37°C下加热10 min，并在酸性缓冲液中在冰上清洗2 min，以去除细胞外TF。通过FACS分析每个细胞的TF信号，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。数据表示为平均值±SEM。
图3
图3。有效感染IAV X31需要完整的MT。
（A） 诺卡唑对IAV X31进入的影响。用30µM诺卡唑或dmso预处理A549细胞30分钟。在药物存在的情况下进行病毒内吞试验（摄取后30分钟）和HA酸化试验（1小时）。数据表示为平均值±SEM。（B）MT扰动物的冲刷分析。用30µM诺卡唑、50 nM紫杉醇或dmso预处理A549细胞30 min。细胞在4°C下与病毒结合30 min，在药物存在下洗涤并加热15、30、45 min和1、2、3、4 h，然后用缓冲至pH 7.4的含有20 mM NH的培养基替换培养基4Cl阻断内体酸化。在12 h时分析感染情况。数据显示为平均值±SEM。（C）IAV X31颗粒的实时成像。将WGA-AF647（5µg/ml）（以绿色假彩色显示）和R18标记的病毒（红色）与对照（All*Neg）、去HDAC8（si-HDAC8）A549细胞在4°C下结合30分钟。清洗后，加热细胞，3小时后用20倍物镜成像（另见视频S1）。单个和聚集的X31粒子显示为黑色圆圈。细胞边界和细胞核用虚线表示。（D） HA酸化发生在Rab7/LAMP1阳性的LE中。对照组（All*Neg），在耗尽后48小时，用表达Rab7-EGFP和LAMP1-mCherry的质粒转染HDAC8-缺失（si-HDAC8）A549细胞。质粒转染24小时后进行HA酸化试验。插图被放大并显示在右侧。蓝色（All*Neg）和黄色箭头（si HDAC8）表示LEs对酸化HA呈阳性。
图4
图4。LE/LY运动需要HDAC8。
内吞EGF的颗粒追踪分析。（A） 对照组（All*Neg）、去HDAC8（si HDAC8）A549细胞和用30µm诺卡唑处理45分钟的细胞（All*Neg+nocod）出现依赖于MT的定向运动（DM）及其速度（µm/s）和（B）持续时间（sec）。（A） 在摄取EGF-AF594（1 ng/ml）后15–30分钟内，使用Visitech旋转圆盘共焦显微镜，使用100倍物镜（2000帧，Δt=30.53 msec）采集视频。成像前20 h用编码NES-2×EGFP的质粒转染细胞，以鉴定细胞质。提取EGF轨迹并将其分为MT依赖型DM（红色）和其他运动类型（蓝色），如面板A的插图所示。在All*Neg（n=6个视频）、HDAC8贫化（n＝8个视频）和诺可达唑处理（n＝8个视频）的样品。针对每种情况，共分析了30–50个细胞。
图5
图5。中心体内聚和中心体MT成核/锚固需要HDAC8。
（A） 对照组（All*Neg）、HDAC8-（si HDAC8）和去根素（si rootletin）A549细胞中α-微管蛋白（绿色）和γ-微管素（红色）的稳态定位。细胞在冷甲醇中固定，并用间接IFA染色。细胞核用DRAQ5染色。底部插图：箭头表示中心体。顶部插图：中心体MT锚固放大图。（B） （C）MT再生分析。对照组（All*Neg）、HDAC8-（si HDAC8）和去根素（si rootletin）A549细胞在冰上培养30分钟以解聚MT，在37°C下加热90秒以诱导重新聚合，并立即固定在冷甲醇中。使用两个针对编码序列（HDAC8）和5′UTR（HDAC8_5UTR）的寡核苷酸耗尽HDAC8。（B） MTplus-end结合蛋白1（EB1）用抗EB1抗体间接IFA染色，细胞核用DRAQ5染色。箭头表示MT asters。（C） 显示MT aster的细胞数量。数据表示为平均值±SEM。（D）MT锚定蛋白ninein在HDAC8缺失后仍留在中心体。对照组（All*Neg）和去HDAC8（si HDAC8）A549细胞在冷甲醇中固定，并用抗中心体标记物ninein和γ-微管蛋白抗体进行间接IFA染色。Ninin与母中心粒的亲和力较高，由箭头指示。（E） 对照组和HDAC8-缺失细胞中心体的激肽信号强度。通过ImageJ采集并分析共焦图像。
图6
图6。中心体分裂阻断IAV X31感染，并被HDAC1耗竭所抵消。
（A） 中心体分裂本身阻断IAV X31感染。A549细胞去除HDAC8、rootletin、ATP6V1B2并感染10 h。数据表示为平均值±SEM。（B）中心体分裂定量。A549细胞去除HDAC1、8、rootletin、HDAC8/1和rootletin/HDAC1，用抗γ-微管蛋白抗体间接IFA固定和染色。通过ImageJ分析来自共聚焦z-stack图像的最大投影，并且将间隔大于2µm的中心体计算为分裂。数据表示为平均值±SEM。（C）中心体距离的量化。A549细胞缺乏HDAC1、8、rootletin、HDAC8/1和rootletin/HDAC1。如图B所示，使用ImageJ测量中心体距离。数据表示为平均值±SEM。（D）色氨酸A（TSA）可抵消HDAC8缺失引起的中心体分裂。去除HDAC8 60 h的A549细胞与dmso或5µM TSA孵育12 h，固定并分析中心体分裂，如上所述。对照细胞与dmso孵育12 h。数据表示为平均值±SEM。（E）HDAC1抵消HDAC8。用不同比例的siRNAs（HDAC1∶HDAC8=0∶20，10∶10，15∶5，17.5∶2.5，20∶0；总计20 nM），感染10 h。数据表示为平均值±SEM。（F）细胞周期分析。将A549细胞去除HDAC1、8并进行胰蛋白酶化，固定在冷EtOH中，用2.5µm DRAQ5染色，并用FACS分析。用FlowJo定量G1、S或G2/M期细胞的百分比。数据表示为平均值±SEM。
图7
图7。HDAC8是感染晚期穿透性病毒所必需的。
A549细胞缺乏HDAC1、8，并感染了VSV（在pH 6.2的EE融合）、UUKV（在pH5.4的LE融合）、IAV（在PH5.1的LEs融合）和VACV MV（在大松果体融合）。通过针对病毒蛋白的间接IFA（针对VSV、UUKV、IAV）或通过EGFP表达（VACV）检测受感染的细胞。使用MATLAB程序算法量化感染细胞的百分比，并将其归一化为对照（All*Neg）细胞。对病毒数量进行了调整，使对照组中20%的细胞受到感染。数据表示为平均值±SEM。
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