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.2012年1月；32(1):36-49.
doi:10.1128/MCB.05857-11。 Epub 2011年10月17日。

O（2）通过磷脂酰肌醇3-激酶/AKT信号调节骨骼肌祖细胞分化

阿马尔·马吉蒙达尔 1, 尼古拉斯·斯科利, 里克森·C·梅斯基塔, Meeri N Kim女士, 阿琼·G·尤德, 米歇尔·Nguyen-McCarty, M Celeste Simon先生
附属公司

O（2）通过磷脂酰肌醇3-激酶/AKT信号调节骨骼肌祖细胞分化

阿马尔·马吉蒙达尔等。 分子细胞生物学. 2012年1月.

摘要

骨骼肌干/祖细胞产生最终分化的肌肉，是骨骼肌疾病的潜在治疗方法。描述调节这些前体的因素将有助于它们在人类肌肉修复中的可靠应用。在胚胎发育和成人再生过程中，骨骼肌祖细胞在局部血管和分化的肌肉形成之前就存在于低氧环境中。先前的研究证实，低氧水平（缺氧）使肌肉祖细胞在体外保持未分化状态，尽管尚不清楚祖细胞分化是否与体内O（2）的可用性相协调。此外，将O（2）与祖细胞分化联系起来的分子信号尚不完全清楚。在这里，我们发现肌肉分化程序受到体外缺氧和体内缺血的抑制。令人惊讶的是，缺氧可以在缺乏缺氧诱导因子（HIF）的情况下显著损害分化，HIF是O（2）的主要发育效应器。为了维持未分化状态，低O（2）水平以主要依赖HIF1α的方式阻断磷脂酰肌醇3-激酶/AKT途径。氧缺乏通过降低胰岛素样生长因子I受体对生长因子的敏感性影响AKT活性。我们得出结论，AKT代表O（2）和骨骼肌分化之间的关键分子联系。

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数字

图1
图1
低O2有效性抑制骨骼肌祖细胞分化体外（A）骨骼肌祖细胞分化模型。谱系标记显示在相应阶段的附近。（B） C2C12成肌细胞在21%或0.5%O中分化96小时2对MHC进行IF。计算融合指数。（C） 在培养于21%或0.5%氧气中的C2C12细胞裂解物中检测到HIF1α、MYOD、肌生成素、MHC和β-微管蛋白的表达水平2分化1、2和3天后。D0，第0天；D1，第1天；D2，第2天；第3天，第3天。（D） C组培养C2C12成肌细胞，肌肉调节因子mRNA表达水平MyoD公司使用从成肌细胞培养物中分离的总RNA，通过qRT-PCR检测肌生成素。显示了3个独立实验的平均值。（E） 在21%O中分化48小时后，在C2C12成肌细胞的裂解液中检测到PARP和AKT的蛋白表达2，0.5%O2或存在细胞毒性物质staurosporine（Sta）。（F） 小鼠原代成肌细胞在21%或0.5%O中分化48小时2对MHC进行IF。计算融合指数。（G） 在来自原代成肌细胞培养物的裂解液中测定肌生成素、MHC和GSK3β蛋白的表达水平，如F组所述，根据Student的吨测试(P（P）< 0.05).
图2
图2
骨骼肌缺血与MRF表达降低相关体内（A）对8至12周龄小鼠进行FAL。用摩尔激光多普勒成像仪评估肢体灌注(n个=11）手术前和手术后立即。显示灌注热图。（B） 按照A组所述进行FAL。术前、术后和结扎后48小时，通过扩散相关光谱评估肢体灌注(n个= 4). （C） 在结扎后48小时，评估无鞭毛（N）和结扎（L）肢体EDL肌肉裂解液中HIF1α和β-微管蛋白的表达水平。（D）MyoD公司在结扎后48小时，根据无鞭毛（NL）和结扎（L）肢体EDL肌肉的总RNA测定肌生成素mRNA水平(n个= 13). （E） 在结扎后48小时，评估非点燃（N）和结扎（L）肢体EDL肌肉裂解物中肌生成素和AKT蛋白的表达水平。*，基于统计显著性差异的学生吨测试(P（P）< 0.05); #, 根据学生的吨测试(P（P）> 0.05).
图3
图3
O（运行）2可用性通过HIF1α依赖和非依赖机制调节骨骼肌成肌细胞分化。（A） 用空载体（Ctl）转导的C2C12成肌细胞或Hif1α-靶向shRNA（shH）在21%或0.5%的O中分化24小时2对HIF1α进行IF。HIF1α+测量了核密度。（B） C2C12细胞培养与A组相同。HIF1α,第1页,MyoD公司测定肌生成素mRNA表达水平。显示了3个独立实验的平均值。（C） 培养C2C12成肌细胞作为A组，收集蛋白裂解物。检测HIF1α、MYOD、肌生成素和β-微管蛋白水平。（D） C2C12细胞转染非特异性siRNA（Ct）或两个独立的Hif1αsiRNAs（H1和H4），并在21%或0.5%的O中分化24小时2测定HIF1α、肌生成素和β-微管蛋白的表达水平。（E） 用空载体（Ctl）转导的C2C12成肌细胞或Hif1α-靶向shRNA（shH）在21%或0.5%O中分化48小时2评估MHC和AKT蛋白水平。（F） 按照面板E所述培养C2C12细胞。进行MHC IF。计算融合指数。（G） mRNA表达水平Hif1α和Hif2α在C2C12成肌细胞、原代小鼠成肌细胞（MB）、原代鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和原代鼠巨噬细胞（Mac）中进行评估。*，基于Student的统计显著差异吨测试(P（P）< 0.05); #, 基于学生的吨测试(P（P）> 0.05).
图4
图4
O（运行）2独立于NOTCH调节成肌细胞分化。（A） mRNA水平你好1,Hey2型,海利牌手表、和赫斯1在21%或0.5%氧中分化24小时后，在C2C12成肌细胞中测量2显示了3个独立实验的平均值。（B）Hey1型在暴露于Fc-JAG1和不同剂量的γ-分泌酶抑制剂DAPT 24小时后，评估C2C12细胞的mRNA表达。（C）海伊2在21%或0.5%氧中分化24小时后，测量C2C12成肌细胞的水平2二甲基亚砜（DMSO）或DAPT处理。给出了5个独立实验的平均值。（D）海伊2在21%或0.5%氧中分化24小时后测量C2C12细胞中的水平2以及IgG或Fc-JAG1。（E） 在21%或0.5%O中分化24小时后，测量C2C12成肌细胞中肌原蛋白和β-微管蛋白的丰度水平2使用二甲基亚砜或两种不同的GSI，DAPT和L-658458。（F） 在21%或0.5%氧气中分化48小时后，测量C2C12细胞的肌生成素、MHC和β-微管蛋白水平2使用DMSO或DAPT。（G） C2C12成肌细胞在21%、1%或0.5%O中分化48小时2在DMSO或DAPT中。对MHC进行IF。计算融合指数。*，基于Student的统计显著差异吨测试(P（P）< 0.05); #, 基于学生的吨测试(P（P）> 0.05).
图5
图5
O（运行）2有效性通过主要依赖HIF1α的机制调节PI3K/AKT途径的活性。（A） PI3K/AKT通路模型。（B） 在21%或0.5%O培养的C2C12成肌细胞的裂解液中检测到P-AKT S473、AKT和一种非特异性蛋白（NS）2用于多日分化。（C） C2C12成肌细胞在21%或0.5%O培养2在分化条件下。在24小时内的不同时间采集细胞用于蛋白裂解物。测定HIF1α、P-AKT S473和AKT丰度水平。（D） C2C12细胞在21%、1%和0.5%O的条件下分化24小时2测定HIF1α、P-AKT S473和AKT表达水平。（E） C2C12细胞在21%、5%、1.5%和0.5%的O下分化24小时2测定HIF1α、P-AKT S473和AKT表达水平。（F） C2C12细胞在分化条件下在21%或0.5%O下培养24小时2从蛋白裂解物中评估P-AKT T308和AKT表达水平。（G） 按照B组所述培养C2C12细胞，并检测裂解物中的P-GSK3αS21/P-GSK2βS9、GSK3β和非特异性带（NS）。（H） 如图F所述培养C2C12成肌细胞。测量P-FOXO3A T32/P-FOXO1 T24、P-P70S6K T389、P70S6K、P-S6 S240/S244、S6和β-微管蛋白的水平。（一） 在21%或0.5%的培养基中分化48小时后，从原代成肌细胞培养物的裂解液中检测到P-AKT S473、P-AKT T308、AKT、P-GSK3αS21/P-GSK2βS9和GSK3β的蛋白表达水平2（J）C2C12成肌细胞用空载体（Ctl）或Hif1αshRNA（shH）并在21%或0.5%O下分化24小时2采用Western blotting法检测HIF1α、P-AKT S473、AKT、P-GSK3αS21/P-GSK2βS9、GSK3β、P-S6 S240/S244和S6的蛋白表达水平。
图6
图6
抑制PI3K或mTORC活性反映了缺氧对成肌细胞分化的影响。（A） 在PI3K抑制剂LY294002（LY）、mTORC抑制剂雷帕霉素（R）、0.5%O2或mTORC抑制剂Torin1（T）。测定肌生成素、P-AKT S473和AKT蛋白水平。（B） C2C12成肌细胞在以下条件下孵育48小时：无药物（21%O2/-)，低氧/无药物（0.5%O2/-)，PI3K激酶抑制剂LY294002（21%O2/或mTORC抑制剂雷帕霉素（21%O2/R） ●●●●。对MHC进行IF。计算融合指数。（C） 在存在或不存在PI3K抑制剂LY294002（LY）、mTORC抑制剂雷帕霉素（R）或mTORC抑制物Torin1（T）的情况下，将C2C12细胞分化48小时。测定MHC和β-微管蛋白表达水平。*，基于Student的统计显著差异吨测试(P（P）< 0.05).
图7
图7
PI3K/AKT信号的去抑制可在缺氧条件下挽救分化。（A） AKT上游磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸（PIP3）代谢模型。（B） 用空载体（MigR）或肉豆蔻酰化AKT（myrAKT）转导C2C12成肌细胞，并在21%或0.5%的氧浓度下分化48小时2评估P-AKT S473、AKT、P-GSK3αS21/P-GSK2βS9和GSK3β蛋白水平。（C） 按照B组所述培养C2C12成肌细胞。使用Alexa Fluor 594结合二级抗体进行MHC IF。计算融合指数。（D） 按照所述培养C2C12成肌细胞，检测MHC和GSK3β的B组蛋白表达水平。（E） C2C12成肌细胞用打乱的shRNA（Ctl）或Pten公司shRNA（shP）并在21%或0.5%O下分化24小时2通过蛋白质印迹测定PTEN、P-AKT S473、AKT、P-GSK3αS21/P-GSK3βS9、GSK3β、P-S6 S240/S244和S6的蛋白质水平。（F） C2C12成肌细胞用打乱的shRNA（Ctl）或铂族shRNA（shP），并在21%或0.5%的O下分化48小时2对MHC进行IF。计算融合指数。（G） 按照面板F的描述培养C2C12成肌细胞。检测裂解液中的PTEN、MHC和AKT。*，基于Student的统计显著差异吨测试(P（P）< 0.05); #, 基于学生的吨测试(P（P）> 0.05).
图8
图8
O（运行）2可用性影响IGF-I受体对生长因子的敏感性。（A） PI3K/AKT上游IGF/胰岛素信号传导模型。（B） C2C12成肌细胞在21%或0.5%O的分化条件下培养24小时2对HIF1α、PERK、XBP1（拼接）、XBPl（非拼接）、CHOP、P-AKT S473和AKT水平进行量化。（C） 按照面板B所述培养C2C12成肌细胞。对P-IRS1 S636/S639、P-IRS1-S307、P-IRS2 S612、IRS1和IRS2蛋白水平进行量化。（D） 按照B组所述培养C2C12成肌细胞。对P-RICTOR S1235、RICTOR和AKT蛋白水平进行量化。（E） 按照B组所述培养C2C12成肌细胞。从成肌细胞蛋白裂解物中测定P-MEK1/2 S217/S221、MEK1/2、P-ERK1/2 T202/Y204和ERK1/2的表达水平。（F） 按照B组所述培养C2C12成肌细胞，并用IGF-I进行脉冲处理。评估P-IGF-IRβY1135（短期和长期暴露）、IGF-IRα和AKT的丰度水平。
图9
图9
O的型号2-骨骼肌成肌细胞中的依赖性信号传导。（A） 低O时2水平（↓O2)，通过诱导HIF1α和抑制PI3K/AKT信号传导抑制祖细胞分化。当O2水平上升（↑O2)，HIF1α蛋白水平降低，AKT活性增加。
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