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.2012年2月；93（第2部分）：235-246。
doi:10.1099/vir.0.034033-0。 Epub 2011年10月12日。

丙型肝炎病毒通过caspase-1炎性小体复合物激活白细胞介素-1β

迪伦·伯代特 1, 亚当·哈斯克特 1, 喷枪加压器 1, 史蒂文·麦克雷 1, 下颚伊克巴尔 1, 古兰·瓦利斯 1
附属公司

丙型肝炎病毒通过caspase-1炎性小体复合物激活白细胞介素-1β

迪伦·伯德特等人。 J Gen Virol公司. 2012年2月.

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摘要

白细胞介素-1β（IL-1β）是一种参与HCV发病机制的有效促炎细胞因子，但促进HCV诱导IL-1β蛋白水解激活和分泌的传感器和潜在机制尚不清楚。在这项研究中，我们发现了一条导致IL-1β激活和分泌的信号通路，以应对HCV感染。先前的研究表明，IL-1β通过巨噬细胞/单核细胞中的炎症小体复合体诱导和分泌。在此，我们首次报道了在感染HCV（JFH-1）的人肝癌细胞中诱导和组装NALP3炎症小体复合物。我们证明，HCV感染细胞中IL-1β的激活涉及前caspase-1在多蛋白炎性体复合体中被蛋白水解为成熟caspase-1的过程。接下来，我们证明HCV是由NALP3蛋白感应的，该蛋白招募衔接蛋白ASC来组装炎症小体复合体。使用小干扰RNA方法，我们进一步表明炎症小体复合体的成分参与了HCV感染细胞中IL-1β的激活。我们的研究还证明了活性氧在HCV诱导的IL-1β分泌中的作用。总之，这些观察提供了对IL-1β处理和分泌机制的深入了解，这可能为靶向病毒或细胞决定簇以阻止慢性HCV感染相关肝病进展提供新的策略。

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图1。
图1。
丙型肝炎病毒激活IL-1β。（a） Huh7.5细胞与HCV细胞培养上清液（m.o.i of 1）孵育6 h，并培养2天和4天。Huh7.5细胞与紫外线照射的HCV或表达JFH-1/GND的细胞上清液孵育6h，培养4d。Huh7.5细胞与LPS（20 ng ml−16小时），然后是ATP（5 mM，20分钟）和h2O（运行）2（500µM持续20分钟）。第4天，用BAF（20 nM，培养12 h）和/或PDTC（100µM，培养6 h）培养HCV感染细胞。将MyD88 siRNA或GFP siRNA转染HCV感染细胞4天。Huh7.5细胞也转染了在体外-转录JFH-1、JFH-1/GND RNA 10小时，或表达HCV p7蛋白的质粒4天。将细胞血清饥饿4h，收集细胞培养上清液，离心并进行IL-1βELISA。此处显示的数据表示平均值+标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。*，P（P）与模拟感染细胞相比<0.05。**，P（P）与第4天HCV感染的细胞相比，<0.05。（b） 丙型肝炎病毒对IL-1βmRNA的诱导作用。如上所述，用HCV细胞培养上清液培养Huh7.5细胞。如方法所述，用NF-κB抑制剂（20µM，6 h）、PDTC（100µM）培养HCV感染细胞，并转染MyD88或GFP siRNA。将细胞血清饥饿4h，提取细胞总RNA并进行cDNA合成。QRT-PCR使用SYBR绿色主混合（ABI）和IL-1β特异性引物集进行。18s rRNA用作内部对照。数值表示平均值+标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。*，P（P）与模拟感染的对照细胞相比<0.05。**，P（P）与第4天的HCV感染细胞相比，<0.05。（c） HCV激活NF-κB。用所示抗体对来自Huh7.5、HCV感染细胞以及经PDTC或NF-κB抑制剂处理的等量细胞裂解物进行Western blot。通道1和通道2，Huh7.5细胞和HCV感染细胞的裂解物；通道3和通道4，分别用PDTC或NF-κB抑制剂处理HCV感染细胞。下图表示HCV NS5A和肌动蛋白对照的表达。
图2。
图2。
丙型肝炎病毒激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1。（a） 将小鼠感染和HCV感染的Huh7.5细胞血清饥饿4 h，细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后使用caspase-1抗体进行Western blot分析。1巷，Huh7.5裂解物；通道2和通道3，感染HCV的Huh7.5细胞的裂解物。底部面板表示HCV核心和肌动蛋白控制的表达。（b） FLICA分析。将小鼠感染和HCV感染的细胞进行血清饥饿处理4 h，并用50µM caspase-1抑制剂（z-VAD-fmk）处理1 h（iv），和用2 h（vi）或100µM caspase-3抑制剂（DEVD）处理1小时（v）和2 h（vii）。细胞与FLICA试剂和Hoescht核染色孵育1小时，然后通过荧光显微镜观察。（c） 使用caspase-1特异性引物对模拟感染细胞和HCV感染细胞的总细胞RNA进行QRT-PCR。此处显示的数据表示平均值+标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。*，P（P）与模拟感染的对照细胞相比，<0.05。
图3。
图3。
HCV诱导NALP3和ASC表达。（a） 使用针对NALP3、HCV核心和肌动蛋白的抗体对模拟感染和HCV感染细胞的总细胞裂解物进行Western blot分析。1巷，Huh7.5裂解物；通道2和3，HCV感染细胞的裂解物。（b） 在第4天从模拟感染和HCV感染的细胞中提取总细胞RNA，并使用NALP1-和NALP3-特异性引物进行QRT-PCR。18S rRNA用作内部对照。此处显示的数据表示平均值+标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。*，P（P）与模拟感染的对照细胞相比，<0.05。（c） HCV诱导ASC。使用抗ASC、HCV NS5A和肌动蛋白抗体对总细胞裂解物进行蛋白质印迹。泳道1，Huh7.5裂解物；通道2和3，HCV感染细胞的裂解物。（d） 使用ASC特异性引物对模拟感染细胞和HCV感染细胞的总细胞RNA进行QRT-PCR。这些值表示平均值+标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。*，P（P）与模拟感染细胞相比，<0.05。
图4。
图4。
HCV感染激活炎症小体复合体。将指定时间点的Mock感染和HCV感染细胞的血清饥饿4 h，并在RT下与NALP3、ASC和HCV NS3抗体孵育1 h，然后与NALP4（抗兔Alexa Fluor 488）、ASC（抗羊Alexa Fuor 546）、NS3（抗鼠Alexa Fluor 633）的二级抗体孵养。DAPI用作核染色剂。箭头表示ASC与NALP3的染色和共定位。棒材，10µm。
图5。
图5。
与图4类似，模拟感染和HCV感染的细胞在RT时用ASC、caspase-1和HCV NS3抗体染色1 h，然后用ASC（抗羊Alexa Fluor 546）、caspase-1（抗兔Alexa Fuor 488）和NS3（抗鼠Alexa Fluor 633）的二级抗体孵育。箭头表示ASC与caspase-1的染色和共定位。棒材，10µm。
图6。
图6。
ASC与NALP3的相互作用。将模拟感染和HCV感染的细胞培养4天，血清饥饿4小时。用抗ASC（a）、抗NALP3（b）或同种对照抗体（c）免疫沉淀来自模拟感染和丙型肝炎病毒感染细胞的等量（500µg）细胞裂解物，并用抗NALP三或抗ASC抗体免疫印迹。1巷，模拟感染裂解物；通道2，HCV感染的裂解物。底部面板表示HCV核心蛋白和肌动蛋白负载控制的表达。（a）和（b）中的通道4代表来自模拟感染和HCV感染细胞的20%输入裂解物。
图7。
图7。
NALP3、ASC和胱天蛋白酶1 siRNA对IL-1β分泌的影响。（a–c）如方法所述，用抗GFP、NALP3、ASC和caspase-1的siRNA转染小鼠感染和HCV感染细胞。第4天，使用TRIzol提取细胞总RNA，合成cDNA，并使用GFP-、NALP3-、ASC-和caspase-1特异性引物进行QRT-PCR（补充表S1）。18S rRNA用作内部对照。此处显示的数据表示平均值+标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。*，P（P）与转染GFP siRNA的对照细胞相比，<0.05。（d） NALP3、ASC和胱天蛋白酶1 siRNA对IL-1β分泌的影响。对来自siRNA-转染模拟感染细胞和HCV感染细胞的细胞培养上清进行IL-1βELISA。*，P（P）与模拟感染的对照细胞相比<0.05。**，P（P）与GFP siRNA转染细胞相比，<0.05。（e） 细胞毒性试验。使用CytoTox-ONE对转染GFP、caspase-1和NALP3 siRNA的模拟感染细胞和HCV感染细胞的等体积细胞培养液进行细胞毒性试验。RFU，相对荧光单位。
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