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.2011年10月5日6:12。
doi:10.186/1750-2187-6-12。

典型Wnt信号通路参与小鼠成肌细胞从细胞增殖向肌源性分化的转换

田中信吾 1, Kumiko Terada公司, 野野聪
附属公司

典型Wnt信号传导参与小鼠成肌细胞从细胞增殖向肌源分化的转换

田中信吾等。 J Mol信号. .

摘要

背景：Wnt/β-catenin信号通路参与骨骼肌发育和再生的各个方面。此外，Wnt3a和β-catenin是胚胎癌细胞中肌肉特异性基因转录和成人骨骼肌再生过程中卫星细胞增殖所必需的。典型Wnt信号的下游靶点是cyclin D1和c-myc。然而，在小鼠成肌细胞C2C12分化过程中，这两个靶基因均受到抑制。肌源性分化期间β-catenin信号传导的潜在分子机制尚不清楚。

结果：利用C2C12细胞，我们检测了成肌细胞增殖和分化过程中的细胞内信号和基因转录。我们证实了一些Wnt信号成分，包括Wnt9a、Sfrp2和豪猪，在分化C2C12细胞时持续上调。肌钙蛋白T阳性肌管因Wnt3a过度表达而减少，但Wnt4没有减少。TOP/FOP报告分析显示，与Wnt4的共同表达降低了Wnt3a诱导的荧光素酶活性，表明Wnt4信号抵消了成肌细胞中的Wnt3a信号。FH535是一种小分子β-连环蛋白/Tcf复合物形成抑制剂，可减少细胞质中的基础β-连环素并减少成肌细胞增殖。蛋白激酶抑制剂K252a增加了细胞溶质和膜结合的β-连环蛋白，并增强了成肌细胞融合。K252a或Wnt4处理导致肌源性分化期间含有磷酸化β-连环蛋白（Tyr654）的细胞质小泡增加。

结论：这些结果表明，各种Wnt配体控制亚细胞β-catenin定位，从而调节成肌细胞增殖和肌管形成。通过β-catenin的Wnt信号可能作为一个分子开关，调节从细胞增殖到肌源性分化的转变。

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数字

图1
图1
C2C12细胞肌源性分化过程中内源性Wnt信号成分的表达Wnt信号分子表达通过定量RT-PCR测定。在分化培养基中培养2或4天后，收集细胞，制备总RNA，并通过实时PCR定量相关基因表达，如下所示：（A）无翼相关MMTV整合，Wnt（重量）; 分泌的卷曲相关蛋白，分泌型卷曲相关蛋白; 和豪猪，猪.（B）卷曲，Fzd公司; 低密度脂蛋白受体相关蛋白，Lrp公司（C）细胞周期蛋白D，抄送; 骨髓细胞瘤病癌基因，Myc公司; 类磷抗原1，化石1; 酪蛋白激酶1，α1，Csnk1a1号机组; 连环蛋白β1，Ctnb1号机组; 蓬乱的1，驱动器1; 糖原合成酶激酶3β，Gsk3b公司; 转录因子3，三氟化碳; 和split 2的转导蛋白样增强子，Tle2号机组第2天和第4天的时间点标准化为第0天的表达水平。数据来自三个独立实验，*P<0.005和†P<0.05。
图2
图2
Wnt4促进C2C12细胞向肌细胞分化将腺病毒载体中Wnt家族成员的表达构建物转染到C2C12细胞中，在分化培养基中培养2天后通过肌钙蛋白T免疫染色测定肌源性分化，并在转染后24小时开始。
图3
图3
Wnt4促进肌源性分化并诱导C2C12细胞融合（A）在含有表达Wnt3a型,重量4,Wnt5a型或电子GFP（控制）。细胞数是三次独立实验的平均值和标准偏差，*与对照组相比，P<0.01。（B） 通过计算表达肌钙蛋白T的融合多核细胞内的细胞核来评估分化的肌管。使用三份培养物中的四个字段来计算分化条件下培养的融合细胞，*与对照组相比，P<0.04。
图4
图4
Wnt表达对细胞迁移的影响用划痕试验测定C2C12细胞的增殖和迁移。在9小时内计数细胞数量，并用延时显微镜监测细胞的迁移率。将0小时（紫色）和9小时（绿色）的相位对比图像合并，以显示表达电子GFP（A） ，Wnt3a型（B） ，重量4（C） 以及Wnt5a型（D） ●●●●。（E） 在9小时内计数的细胞数量汇总（细胞/场），其中n=3用于对照，Wnt3a和Wnt4，n=4用于Wnt5a*P<0.01；†与eGFP相比，P<0.02。
图5
图5
Wnt4降低Wnt-3a诱导的成肌细胞转录活性报告者分析使用C2C12细胞中的TOP/FLASH和FOP/FLASH（荧光素酶分析）进行。Wnt3a型与FOP相比，TOP中的萤光素酶活性显著增加。（A）重量4对荧光素酶活性没有影响，而重量4禁止Wnt3a型活动。（B）Wnt5a型抑制不良Wnt3a型活动。横条是四个独立实验的手段*TOP和FOP之间P<0.01；P<0.01介于Wnt3a型和Wnt3a型+重量4在TOP中；P<0.02介于Wnt3a型和Wnt3a型+Wnt5a型位于顶部。
图6
图6
β-catenin和肌钙蛋白T在增殖分化C2C12细胞中的定位对增殖分化培养基中培养的C2C12细胞进行β-catenin（A，B；红色）和肌钙蛋白T（C，D；绿色）双重免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行复染。合并带有各种滤光片的免疫荧光图像（E，F）。
图7
图7
小分子抑制剂对C2C12细胞增殖和分化的影响C2C12细胞在不含抑制剂（A-D）的情况下培养，并加入1μM FH535（E-H）、1μM GW9662（I-L）和3.6 nM K-252a（M-P），然后用抗肿瘤素T（A、B、E、F、I、J、M、N）和抗β-连环蛋白（C、D、G、H、K、L、O、P）抗体进行免疫染色。FH535干扰β-catenin/Tcf复合物的形成，而GW9662在结构上与FH536相似，但不干扰复合物的生成。K252a是一种Trk激酶抑制剂，在酪氨酸654处磷酸化β-连环蛋白。
图8
图8
FH535和K252a改变C2C12细胞中的总蛋白和磷酸化-β-连环蛋白（Y654）（A）使用抗细胞总β-连环蛋白抗体（上表）和磷酸化β-连环素抗体（下表）对FH535和K-252a处理的C2C12细胞的细胞溶质和膜部分进行蛋白质印迹。GRP78表示装载控制。（B，C）细胞溶质（黑色）和膜（灰色）组分中的总β-连环蛋白和磷酸化β-连环素的相对水平计算为β-catenin/GRP78比率。带强度与细胞溶质部分中的对照细胞值相关，定义为1.0。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图9
图9
FH535和K252a对C2C12细胞增殖和分化的影响C2C12细胞在不同FH535和K252a浓度下培养，然后进行肌钙蛋白T免疫染色。总细胞数是DAPI染色的细胞核计数，融合指数是肌钙蛋白T阳性细胞中多核细胞的百分比*P<0.001 vs.缺乏抑制剂。
图10
图10
Wnt家族成员对C2C12细胞中β-catenin磷酸化和亚细胞定位的差异调节（A-D）C2C12细胞在有或无K252a的情况下培养，然后对磷酸化-β-连环蛋白（Y654）进行免疫染色。K252a导致C2C12细胞中含有磷酸化-β-连环蛋白（Y654）的小泡堆积。（E-L）Wnt3a型,重量4和Wnt5a型通过腺病毒介导的基因转移在C2C12细胞中过度表达。在分化培养基中培养2天后，转染后24小时开始，通过免疫染色测定亚细胞磷酸化-β-连环蛋白（Y654）的定位。（M-T）C2C12细胞表达电子GFP,Wnt3a型,重量4和Wnt5a型用抗pan-β-catenin抗体进行免疫染色。细胞质β-连环蛋白升高Wnt3a型在增殖培养基中表达，在分化培养基中保持较高水平，而核和膜结合的β-连环蛋白随着重量4表达式。
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