CTCF-promoted RNA polymerase II pausing links DNA methylation to splicing

doi:10.1038/nature10442

.2011年11月3日；479(7371):74-9.

doi:10.1038/nature10442。

CTCF介导的RNA聚合酶II暂停连接DNA甲基化与剪接

桑吉夫·舒克拉¹, 埃尔森·卡瓦克, 梅丽莎·格雷戈里, 今岛正彦, 博扬·舒蒂诺斯基, 米哈伊尔·卡什列夫, 菲利普·奥伯多费尔, 里卡德·桑德伯格, 沙利尼·奥伯多费尔

附属公司

PMID： 21964334
PMCID公司： PMC7398428
DOI（操作界面）： 10.1038/自然10442

CTCF介导的RNA聚合酶II暂停连接DNA甲基化与剪接

桑吉夫·舒克拉等。自然. 2011.

.2011年11月3日；479(7371):74-9.

doi:10.1038/nature10442。

作者

桑吉夫·舒克拉¹, 埃尔森·卡瓦克, 梅丽莎·格雷戈里, Imashimizu Masahiko, 博扬·舒蒂诺斯基, 米哈伊尔·卡什列夫, 菲利普·奥伯多费尔, 里卡德·桑德伯格, 沙利尼·奥伯多费尔

附属

¹美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所小鼠癌症遗传学项目癌症研究中心，邮编：21702。

PMID： 21964334
PMCID公司： PMC7398428
DOI（操作界面）： 10.1038/自然10442

摘要

信使前RNA的选择性剪接是真核细胞转录组扩增的一个关键特征，但其调控机制尚不清楚。剪接体组装以共转录方式发生，这增加了DNA结构可能直接影响选择性剪接的可能性。支持这种联系的是，最近的报告已经确定了不同的组蛋白甲基化模式，核小体占有率升高，外显子相对于内含子的DNA甲基化富集。此外，转录延伸率与选择性剪接有关。在这里，我们提供了第一个证据，证明DNA结合蛋白CCCTC-结合因子（CTCF）可以通过介导局部RNA聚合酶II在哺乳动物选择性剪接、CD45和全基因组模型系统中暂停，促进弱上游外显子的包含。我们进一步表明，DNA甲基化抑制了CTCF与CD45外显子5的结合，从而对外显子5inclusion产生了相互影响。这些发现为通过可遗传的表观遗传标记调控剪接结果的发育提供了一个机制基础。

PubMed免责声明

数字

**图1|。CTCF与第5外显子的结合*CD45型*DNA与第5外显子在*CD45型*抄本。**
一小鼠脾细胞中的CTCF ChIP和与兔Ig对照ChIP相关的定量PCR（qPCR）(n个= 2).b、亲代BL41 B细胞（RB）中CD45RA（含外显子4）和CD45RB（含外显子5）亚型及总CD45（pan）的细胞表面染色^高的)、细胞培养衍生的CD45RB双峰细胞和CD45RB-低（RB^低的)从双峰BL41群体中分离出的细胞。**c（c）**,*GAPDH公司*-来自RB的标准化qRT-PCR数据^高的和RB^低的使用指定连接跨度引物的细胞(*n个=*3).d日RB BJAB的CTCF ChIP^高的和RB^低的细胞和qPCRCD45型外显子和内含子(*n个=*3–6). 所有图表均显示平均值±标准偏差（s.d.）。*P（P）*=双尾学生t吨对指示的样品进行测试比较。

**图2|。CTCF缺失导致外显子5内含子减少*CD45型*抄本。**
一细胞表面CD45RB亚型和CD45在用短发夹RNA（shRNA）转导对抗CTCF（CTCF-sh3和/或sh-4）或控制shRNA对抗红色荧光蛋白（RFP）的细胞中的总表达。b,**c（c）**，qRT-PCR在CTCF-缺失RB中^低的(b)和BJAB细胞(**c（c）**)来自一检测*CD45型*（左）和*CTCF公司*（右）mRNA水平(*n个=*3). 图表显示平均值±标准差。*P（P）*，双尾学生t吨测试。

**图3|。CTCF在*CD45型*第5外显子DNA通过局部pol II暂停促进CD45转录物中第5外显子的包含。**
一、RNA pol II ChIP和qPCR相对于小鼠Ig对照IP(n个= 3).bRB中的CTCF ChIP^高的shRNA转导的细胞*CTCF公司*与shRFP转导细胞和qPCR相对兔Ig对照IP(n个= 2).c（c）RB的RNA pol II ChIP^高的单元格来自b与小鼠Ig对照IP相关的qPCR(n个= 2).d日,体外与DNA寡核苷酸结合的CTCF结合位点在相对于伸长复合物组装的位置26处的转录。如图所示，引入了重组CTCF和TFIIS蛋白，在腺嘌呤21（A21）处暂停有不同的效果。**e（电子）**，代表*CD45型*具有野生型（I3-I7）或突变外显子5 CTCF结合位点（I3-I 7）的微小基因**CTCF公司*)，用于**f–j。如果**NIH3T3和CHO细胞中的CTCF-ChIPCD45型与兔Ig对照IP相关的微基因和qPCR。误差条表示平均值的标准误差（s.e.m.）(*n个=*3).g–i类、qRT-PCR检测小基因转染的HEK293、NIH3T3和CHO细胞外显子4/5的连接(克), 5/6 (小时)和4/6(我)相对于外显子6(*n个=*3).j个，RNA pol II ChIP转染CHO细胞*CD45型*与小鼠Ig控制IP相关的微基因和qPCR(n个= 3). 除非另有说明，否则图表显示平均值±标准差。*P（P）*，双尾学生t吨测试。

**图4|。5-甲基胞嘧啶水平（5-mC）与CTCF结合和外显子5内含物呈负相关。**
一B细胞系基因组DNA中甲基化DNA免疫沉淀（MedIP）和相对于输入的qPCR(n个= 5).b，CD45亚型在原发性外周血人CD3中的代表性表达⁺根据细胞表面CD45RB和CD45RO对T细胞进行分类。**c（c）**、MedIP和qPCR相对于分选的初级人类CD3中的输入⁺T细胞(n个=6，由两名捐赠者汇编）。d日在分选的初级CD3中，CTCF-ChIP和qPCR相对于兔Ig对照IP⁺T细胞(n个= 2).e（电子）与BL41 RB输入相关的MedIP和qPCR^低的shRNA转导的细胞*DNMT1（DNMT1）*与shRFP转导的细胞相比(n个= 3).如果，来自的细胞中的CTCF ChIPe（电子）与兔Ig对照IP相关的qPCR(n个= 3).克，细胞表面CD45RB在来自**e（电子）**.小时细胞中RNA pol II ChIP和qPCRe（电子）相对于小鼠Ig控制IP(n个= 3). 除非另有说明，否则图表显示平均值±标准差。*P（P）*，双尾学生t吨测试。

**图5|。CTCF依赖性外显子的全球鉴定。**
一，根据外显子1 kb范围内唯一CTCF峰的相对位置对备选外显子进行分类。b，shRNA转导的双峰BL41细胞平均外显子内含物水平的差异*CTCF公司*与shRFP转导的细胞（来自图2a）相比，CTCF峰值位于上游（蓝色）或下游区域（红色）但不在外显子体中的外显子和无CTCF结合的外显体（黑色）。平均值^±根据贝叶斯因子阈值的增加绘制每类外显子的s.e.m**P（P）* ^<0.05, ***P（P）* ^<0.01, ****P（P）* ^<0.001，Wilcoxon秩和检验不同阈值下外显子包含差异。**c（c）**，与相同bBJAB shCTCF与野生型BJAB细胞的比较（见图2a）。d日，标准化CD4⁺T细胞RNA pol II读取信号集中在选择性外显子或相应的下游CTCF峰值。

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