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比较研究
.2011年9月28日；31（39）：13746-57。
doi:10.1523/JNEUROSCI.1078-11.2011。

同源多巴胺相互作用蛋白激酶2通过BMP信号调节肠多巴胺能神经元和胶质细胞的出生后发育

阿尔克梅内·查拉佐炎 1, 艾米·A·唐, 尚玉蕾, Tuan D Pham公司, 谢长廷（Ivy Xieh）, 旺达·塞特利克, 迈克尔·D·格尔森, 埃里克·J·黄
附属公司
比较研究

同源多巴胺相互作用蛋白激酶2通过BMP信号调节肠多巴胺能神经元和胶质细胞的出生后发育

阿尔克梅内·查拉佐炎等。 神经科学. .

摘要

营养因子信号对肠神经元在发育过程中的迁移、分化和存活至关重要。然而，调节出生后肠道神经元成熟的机制尚不清楚。在这里，我们证明转录辅因子HIPK2（同源域相互作用蛋白激酶2）是肠神经元成熟和出生后发育期间调节胶质生成所必需的。缺乏HIPK2的小鼠表现出胃肠道（GI）表型谱，包括结肠扩张和胃肠道转运时间减慢。尽管HIPK2的缺失在产前发育中不会影响肠道神经元，但在HIPK2（-/-）突变小鼠的出生后生活中会发生肠道神经元的渐进性缺失，这优先影响肠道尾部区域的多巴胺能神经元群。HIPK2调节出生后肠神经元发育的机制似乎涉及肠神经元对骨形态发生蛋白（BMP）的反应。具体而言，与野生型小鼠相比，Hipk2（-/-）突变体中肠神经元的磷酸化Smad1/5/8水平异常高。Hipk2（-/-）突变体显示肠神经系统中的胶质细胞显著增加，这与BMP信号促进胶质生成的能力一致。此外，Hipk2（-/-）突变体肠神经元中的自噬体数量增加，突触成熟受阻。这些结果揭示了HIPK2作为一种重要的转录辅因子在肠神经元和胶质细胞维持中调节BMP信号通路的新作用，并进一步表明HIPK2及其相关信号机制可能在治疗上被改变以促进出生后神经元的成熟。

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数字

图1。
图1。
围生儿死亡率和胃肠道表型嘻哈2−/−突变小鼠。A类——B类.超过40%嘻哈2−/−混合组中的突变小鼠129只；B6背景在出生后死亡，大多数在出生后2天内死亡(A类). 大多数垂死的人嘻哈2−/−突变体没有胃里有牛奶的迹象（箭头突出显示）(B类，顶部）。相比之下野生型室友吐奶(B类，顶部，箭头）。尸检嘻哈2−/−P0处的突变小鼠显示肠道轻度扩张，充满气体(B类，底部，箭头）。C类，与正常体重增长相比野生型小鼠出生后12周内，臀部2−/−两种性别的突变小鼠均表现出体重增加减少，但不影响身体长度（数据未显示）。D类——G公司，成人嘻哈2−/−突变小鼠（8-12周龄）胃肠转运时间延长(D类)，减少排便量(E类，F类)减少粪便中的水分(G公司). 学生的t吨测试，n个=6，用于野生型和嘻哈2−/−突变体*第页< 0.05.
图2。
图2。
出生后阶段肠神经元HIPK2的表达。A类——C类，可以使用HIPK2检测HIPK2的表达LacZ公司在十二指肠肌间丛(A类)、小肠(B类)、和冒号(C类). 比例尺：（英寸C类)A类——C类，50微米。D类——我，共聚焦图像表明内源性HIPK2蛋白(D类——F类)，使用抗HIPK2抗体和HIPK2检测LacZ公司(G公司——我)用抗β-半乳糖苷酶抗体检测，显示与神经元标记物TuJ1广泛共定位。注意HIPK2蛋白(D类——F类（绿色通道）在肠神经元的细胞核（TuJ1+，红色通道）中以点状存在。浆膜层纤维组织中检测到绿色通道中的背景染色(G公司，我). 比例尺：（英寸我)D类——我，20微米。J型——N个，HIPK2在成年小鼠肠道神经元中的表达也可以通过HIPK2的整体染色来检测LacZ公司在回肠和近端结肠的肌间神经丛中。注意HIPK2的不同聚合LacZ公司在肌间神经丛中（箭头突出显示），周围弥漫着浅绿色的HIPK2LacZ公司活性进入邻近组织(J型，K（K）). 共焦显微镜显示HIPK2的广泛共定位LacZ公司图J1位于P32(L（左）——N个). 比例尺：（英寸K（K）)J型，K（K），200微米；（英寸N个)左旋-右旋，20微米。
图3。
图3。
十二指肠、回肠和结肠肌间神经丛的神经节大小和节间神经纤维减少臀部2−/−出生后阶段的突变体。A类——F类，十二指肠、回肠和近端结肠的整体AChE染色显示肌间神经丛（箭头）缩小，神经纤维染色强度降低嘻哈2−/−突变体（箭头）早在P0。比例尺：（英寸F类)A类——F类，200微米。G公司——L（左）肌间神经丛和神经纤维的缩小在嘻哈2−/−P35处的突变比P0处的突变，尤其是结肠。比例尺：（英寸L（左）)G公司——L（左），200微米。
图4。
图4。
肠神经元，包括多巴胺能神经元的丢失臀部2−/−出生后生活中的突变小鼠。A–D，肌间神经丛和粘膜下神经丛的全套铜蛋白蓝染色显示成人的神经元密度降低嘻哈2−/−突变小鼠。比例尺：（英寸D类)A类——D类，100微米。E类，F类，肌间神经丛神经元的年龄依赖性减少嘻哈2−/−突变体。在P1，肌间神经丛的单位面积没有可检测到的神经元丢失嘻哈2−/−突变体。然而，从P14到P85（或12周龄）的肌间神经丛中存在神经元的渐进性丢失嘻哈2−/−突变体。肌间神经丛神经元的年龄依赖性减少嘻哈2−/−突变体表现为单位面积的神经元密度(E类)或以百分比表示野生型神经元(F类).G公司，与肌间神经丛相似，12周龄的粘膜下神经丛也检测到神经元密度降低（P84）嘻哈2−/−突变体。H（H）——M（M），通过在胃粘膜下神经丛中制备多巴胺（红色）和酪氨酸羟化酶（绿色）双重免疫荧光的全套制剂，鉴定ENS中的多巴胺能神经元野生型(H（H）——J型)和臀部2−/−突变小鼠(K（K）——M（M）). 注意，多巴胺能神经元在嘻哈2−/−突变体与野生型室友。比例尺：（英寸M（M）)H（H）——M（M），50微米。N个对十二指肠、空肠、回肠和结肠中多巴胺能神经元密度的量化显示，所有区域的多巴胺能神经密度持续降低。哦，P（P），即使多巴胺能神经元密度标准化为粘膜下神经丛中神经元总数的比例(哦)或作为野生型室友(P（P）)，空肠、回肠和结肠仍显著减少。在P84时，每个基因型至少有三只动物被计数，肠道每个区域的测量总数如下所示：十二指肠(野生型，n个= 36;嘻哈2−/−，n个= 42); 空肠(野生型，n个= 36;嘻哈2−/−，n个= 23); 回肠(n个=每个基因型30）；和冒号(n个=每个基因型13）。学生的t吨测试*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.005和ns（不显著）。
图5。
图5。
嘻哈2−/−突变小鼠显示回肠肌间神经丛和粘膜下神经丛中TrkC+神经元减少。A类，B类，整体免疫组化显示十二指肠-空肠和回肠肌间神经丛TrkC+神经元减少(A类). TrkC+神经元的减少也见于嘻哈2−/−突变体(B类)但不在十二指肠-空肠。C类、TrkC+神经元密度嘻哈2−/−突变体肌间神经丛，表示为野生型同窝出生的对照组显示回肠的减少更为显著(n个=15）比十二指肠-空肠(n个= 21,第页< 0.0001). 相反，粘膜下丛TrkC+神经元的减少仅在回肠中显著(n个= 21). 星号（*）表示与野生型; 学生的t吨测试，第页< 0.0001.
图6。
图6。
HIPK2的缺失导致pSmad1/5/8在肌间丛和粘膜下丛的肠神经元中的表达增加。A类——F类，整体免疫染色显示肌间神经丛中pSmad1/5/8阳性神经元显著增加(A类，B类)和粘膜下丛(C类，D类)在12周龄的回肠和结肠中（P84）嘻哈2−/−突变小鼠与野生型注意，pSmad1/5/8免疫染色的强度在肠神经元之间变化。为了保持一致，强烈阳性和中度阳性的肠神经元都计算为比例尺：（inD类)A类——D类，50微米。E类，F类组织学切片显示细胞核pSmad1/5/8（绿色荧光）和神经元标记物TuJ1（红色荧光）在肌间神经丛中的共定位野生型和嘻哈2−/−突变体。比例尺：（英寸F类)E类，F类，10微米。G公司，在野生型肌间神经丛，5.97±0.54%(n个=30）和16.2±1.4%(n个回肠和结肠的pSmad1/5/8阳性染色。相反，回肠和结肠的pSmad1/5/8阳性神经元分别为20.8±1.4%和47.2±4.7%嘻哈2−/−突变体。在回肠粘膜下丛中也检测到pSmad1/5/8的类似增加嘻哈2−/−突变体，32.8±2.7%(n个=26）相比16.7±1.3%(n个=35）英寸野生型.学生的t吨测试，n个=每个基因型5个，以及第页< 0.005. 请注意，pSmad1/5/8免疫染色神经元的增加比例明显更高(第页<0.005）在结肠中比在回肠中嘻哈2−/−老鼠。
图7。
图7。
嘻哈2−/−突变小鼠的肌间神经丛和粘膜下神经丛中的胶质细胞密度增加。A类——C类，共焦图像显示HIPK2的表达LacZ公司胶质细胞（抗β-半乳糖苷酶抗体检测）（抗S100β抗体检测）。P0时，肠神经胶质细胞中HIPK2的表达非常有限(A类). 然而，HIPK2的表达LacZ公司显示P16的胶质细胞逐渐增多(B类)和第32页(C类)（箭头）。比例尺：（英寸C类)A类——C类，20微米。D类——G公司S100β的整体免疫染色显示，12周龄婴儿的肌间神经丛和粘膜下神经丛中的肠神经胶质细胞增多嘻哈2−/−突变体与它们的野生型室友(n个=3，每个）。这些图像是使用40倍物镜在微分干涉对比显微镜下拍摄的，这样可以更好地描绘胶质和神经元细胞体。请注意，胶质细胞体及其小细胞核（箭头所示）的棕色免疫反应描绘出神经节，胶质突起包裹着主要由较大神经元细胞体和细胞核构成的浅色腔隙。比例尺：（英寸E类，G公司)D类——G公司，50微米。H（H），胶质密度（每毫米2肌间神经丛增加嘻哈2−/−突变小鼠在十二指肠-空肠和回肠中均存在，但回肠中的突变小鼠数量显著高于对照组。我，粘膜下丛胶质细胞密度嘻哈2−/−突变体仅在回肠中显著增加。J型，胶质细胞密度标准化为野生型证实了以毫米表示的数据2神经丛。
图8。
图8。
肠神经元自噬增加嘻哈2−/−突变体。A类——D类电子显微镜分析显示轴突和细胞质中的自噬体数量增加臀部2−/−P16突变(B类，D类，箭头）。相反野生型小鼠出现紧密的束，没有自噬体的证据(A类，C类). 比例尺：（英寸B类，D类)A类——D类500微米。E类，自噬体数量的量化（每10个−3μm2表面积）(n个=31英寸野生型和n个=15英寸嘻哈2−/−突变体），十二指肠(n个=21英寸野生型和n个=16英寸臀部2−/−突变体），回肠(n个=31英寸野生型和n个=20英寸嘻哈2−/−突变体）和结肠(n个=20英寸野生型和n个=24英寸嘻哈2−/−突变株）。虽然在胃和十二指肠中检测到自噬体没有显著差异，但在肠和结肠中有显著增加嘻哈2−/−突变体。F类，G公司与EM结果一致嘻哈2−/−P7处的突变体显示LC3免疫荧光信号弥漫增加（箭头）。比例尺：（英寸G公司)F类，G公司，20微米。
图9。
图9。
肌间神经丛神经节内突触减少嘻哈2−/−突变体。A–F突触蛋白SNAP-25的免疫荧光图像显示P36结肠肌间神经丛（MP）和粘膜下神经丛（SMP）的信号强度降低臀部2−/−突变体。箭头表示肌间神经丛中的神经元，箭头表示粘膜下神经丛的神经元。比例尺：（英寸F类)A类——F类，40微米。G公司——J型，成人回肠和近端结肠肌间神经丛突触的典型EM图像野生型(G公司和我）和嘻哈2−/−突变体(H（H）和J型）。而突触在肠神经元中发育良好野生型老鼠(G公司，我)，肠神经元臀部2−/−突变体显示回肠和近端结肠的突触数量减少(H（H），J型). 比例尺：（英寸J型)G公司——J型，1微米。K（K），单位面积突触数量的量化（×10−3μm三)在十二指肠（D）、回肠（I）和近端结肠（PC）中，P0和P36显示出生后ENS的突触密度显著增加野生型老鼠。相反，嘻哈2−/−突变小鼠在P0时表现出突触密度的适度降低，而从P0到P36时突触密度没有进一步增加。
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