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.2011;6（9）：e23943。
doi:10.1371/journal.pone.0023943。 Epub 2011年9月2日。

Hedgehog信号拮抗剂促进原发性肝癌小鼠模型中肝纤维化和肝癌的消退

乔治·菲利普斯 1, 艾萨克·S·陈, 马尔泽娜·斯威德斯卡, 凡妮莎·施罗德, 辛西娅·盖伊, 游戏F卡拉卡, 辛西娅·莫伊兰, Talaignair Venkatraman公司, 塞巴斯蒂安·费尔林, Wing-Kin同步, 容美美（Youngmi Jung）, 拉斐尔·维特克, 史蒂夫·崔, 格雷戈里·米歇洛蒂, Fatima Rangwala公司, 埃尔马尔·默克尔, 克里斯托弗·拉斯科拉, 安娜·梅·迪尔
附属公司

Hedgehog信号拮抗剂促进原发性肝癌小鼠模型中肝纤维化和肝癌的消退

乔治·菲利普斯等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

目标：慢性纤维化肝损伤是人类肝癌发生的主要危险因素。Mdr2（MDR3的小鼠同源基因）靶向缺失的小鼠发生慢性纤维化肝损伤。在50-60周龄的小鼠中，肝细胞癌（HCC）会自发出现，这提供了一种纤维化相关肝癌发生的模型。我们使用Mdr2（-/-）小鼠来研究刺猬（Hh）信号通路激活促进肝纤维化和肝癌发展的假设。

方法：对Mdr2（-/-）小鼠和年龄匹配的野生型对照组的肝损伤和纤维化、Hh途径激活和肝祖细胞群体进行比较。用Hh信号拮抗剂GDC-0449进行剂量发现实验，以优化Hh途径抑制。然后用GDC-0449或载体治疗小鼠9天，通过免疫组织化学、qRT-PCR、Western blot和磁共振成像评估对肝纤维化和肿瘤负担的影响。

结果：与对照组不同，Mdr2（-/-）小鼠持续表达Hh配体，并随着年龄的增长逐渐积累Hh反应性肝肌成纤维细胞和祖细胞。GDC-0449治疗老年Mdr2缺乏小鼠显著抑制肝Hh活性，减少肝肌成纤维细胞和祖细胞，减少肝纤维化，促进肝内肝癌的消退，减少转移性肝癌的数量，但不增加死亡率。

结论：Hh途径激活可促进肝纤维化和肝癌发生，抑制Hh信号可安全逆转这两个过程，即使纤维化和HCC进展。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Mdr2肝刺猬（Hh）通路活性增加−/−老鼠。
A。幼年Mdr2全肝提取物中Sonic Hedgehog（SHh）和Indian Hedgehog（IHh）的Western blot分析−/−小鼠（2-16周龄），年龄（36-64周龄）Mdr2−/−小鼠和年龄匹配的对照组（n=3-5只/组/时间点）。展示了一个代表性的证明幼鼠结果的Western blot。绘制了老年小鼠的平均值±扫描电镜数据。B。年轻（4周龄）、中年（36周龄）和老年（52周龄）Mdr2的代表性肝脏切片染色显示Gli2−/−老鼠。在任何年龄的野生型小鼠中都观察到少量Gli2表达，因此显示了一只具有代表性的36周龄野生型小鼠的结果。(10×)C、。定量Gli2免疫组化数据。在Mdr2的每个肝脏切片中，至少在5个高倍视野（HPF）中计数核Gli2（+）细胞的数量−/−绘制4周龄、36周龄和64周龄小鼠和野生型对照组（n=3-4只/组/时间点）的平均值±SEM*Mdr2中的p<0.05，**p<0.01−/−各组与各自的对照组。
图2
图2。Hedgehog（Hh）抑制剂GDC-0449消除肝实质和肝癌结节内Hh信号的作用。
A。代表性二甲基亚砜和GDC-0449处理小鼠（40×）的肝脏切片进行Gli2染色。使用二甲基亚砜或GDC-0449（n=9–10/组）治疗的小鼠非肿瘤肝脏的Gli2定量免疫组化数据用平均值±SEM表示(**p<0.01在40倍放大的条件下，计算每个门静脉道/节段中Gli2阳性染色的导管细胞数量。B。相同小鼠的肿瘤切片也进行了染色，以显示Gli2。显示了典型DMSO和GDC-0449处理小鼠的结果。通过在40倍放大镜下计数肿瘤切片中的核Gli2阳性导管和肝细胞，生成定量Gli2免疫组化数据。结果以平均值±SEM Gli2-阳性细胞/40×高功率场表示（**p<0.01）C–D类二甲基亚砜（开放条形）和GDC-0449（黑色条形）处理小鼠的全肝RNA的定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析。C、。PPAR-γ，一种通常被Hh信号抑制的基因。D。Gli1，一种由Hh信号传导诱导的基因。绘制平均值±SEM（**p<0.01）。
图3
图3。GDC-0449治疗减少Mdr2的纤维化−/−老鼠。
A。年龄匹配的典型Mdr2非肿瘤肝脏切片中α-SMA（顶面）和天狼星红（底面）的免疫组织化学染色−/−野生型小鼠（10×）。B。肝脏羟脯氨酸总含量为2–52周龄野生型（WT）和年龄匹配的Mdr2−/−小鼠（n=3-5/组）。Mdr2结果−/−将小鼠归一化为年龄匹配的WT小鼠，并绘制出折叠变化图。数据显示为平均值+/-SD（*p<0.05）C、。在典型的DMSO和GDC治疗的Mdr2中，对非肿瘤肝脏切片进行α-SMA（顶面，20×）和天狼星红（底面，10×）染色−/−老鼠。D。DMSO和GDC处理小鼠的肝羟脯氨酸含量（n=9/组）。GDC-0449处理小鼠的结果被归一化为DMSO车用处理小鼠的值，并以倍数变化的形式绘制。数据显示为平均值+/-SEM（*p<0.05）。
图4
图4。Mdr2缺乏和Hedgehog（Hh）抑制对肝祖细胞群体的影响。
A。年龄匹配的典型Mdr2肝切片的免疫组织化学染色−/−以及野生型小鼠的祖细胞标记物、细胞角蛋白-19（CK-19）（顶部面板）和α-甲胎蛋白（AFP）（底部面板）（20×）。B。Mdr2肝门静脉三联体的典型显微照片−/−小鼠，显示CK-19（蓝色）和Gli2（棕色）在导管室（40×）共同定位。C、。DMSO和GDC-0449处理的Mdr2中Gli2和CK19的定量免疫组化−/−小鼠（n=9–10/组）。在20倍放大镜下计数肿瘤内Gli2和CK19双阳性导管样细胞的数量。绘制每个高功率场（HPF）的平均值±SEM双（+）细胞t（*p<0.05）D。DMSO（开条）或GDC-0449（闭条）处理小鼠肿瘤RNA中AFP的QRT-PCR分析结果GDC-0449-处理小鼠的AFP归一化为DMSO载体处理小鼠的结果，并以平均值±SEM表示（*p<0.05）。
图5
图5。抑制Hh信号降低老年Mdr2肿瘤和瘤周组织中骨桥蛋白和骨桥蛋白应答（CD44）阳性细胞−/−老鼠。
A。代表性DMSO和GDC-0449治疗Mdr2的肿瘤切片−/−对小鼠进行染色以显示骨桥蛋白（OPN）代表性切片(右侧面板). OPN染色通过20倍放大镜对每个肿瘤切片至少5个HPF进行形态计量分析进行量化（n=5只小鼠/组）。GDC-0449治疗组的结果被归一化为DMSO载体组的结果，并以折叠变化的形式表示。数据显示为平均值±SEM（**p<0.01）。B。典型二甲基亚砜和GDC-0449治疗的Mdr2肿瘤周围组织中骨桥蛋白受体CD44的免疫组织化学染色−/−老鼠。(右侧面板)如A中所述，通过形态计量分析对CD44染色进行量化。GDC-0449处理小鼠的结果与车辆处理对照小鼠的结果进行了标准化，并以平均值±SEM表示（**p<0.01）。C、。DMSO-（开条）和GDC-0449-（闭条）治疗的Mdr2肝肿瘤RNA的QRT-PCR分析−/−OPN（左）和CD44（右）小鼠。将DMSO治疗组的结果归一化后，绘制平均值±扫描电镜图（*p<0.05）。
图6
图6。磁共振成像（MRI）显示，Hh通路抑制可降低肝脏肿瘤体积，并诱导肿瘤消退的组织学特征。
A。GDC-0449治疗后通过对比增强MRI确定的肝内肿瘤的典型横断面图像。B。用于体积分析的矢状、冠状和斜向透视的代表性MRI图像。C、。肿瘤体积的变化通过计算机生成的体积测量进行量化，并以平均值±标准偏差（*p<0.05）表示。D。GDC-0449治疗引起的典型组织学变化的显微照片。顶部面板显示肿瘤坏死；中间板显示脂肪变性；底部显示空泡状肿瘤细胞，细胞核固缩。
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