跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

网站是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011;6（8）：e23899。
doi:10.1371/journal.pone.0023899。 Epub 2011年8月31日。

钙粘蛋白在上皮-间质转化过程中Wnt/β-catenin信号转导中的积极作用

萨拉·霍华德 1, 汤姆·德鲁, 藤田康树, 藤崎信步
附属公司

钙粘蛋白在上皮-间质转化过程中Wnt/β-catenin信号转导中的积极作用

萨拉·霍华德等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

Wnt/β-catenin信号通路与钙粘附素为基础的粘附系统共享一个关键成分β-catening。β-连环蛋白的信号传导功能是由可溶性细胞质库赋予的，在没有Wnt信号的情况下，可溶性细胞质库是不稳定的，而粘附功能是基于膜上钙粘蛋白结合的稳定库。钙粘蛋白复合物是动态的，允许细胞-细胞重排，如上皮-间充质转化（EMT），复合物通过内化在其中翻转。这两个池之间的潜在相互作用尚不清楚，但钙粘蛋白通常被认为是Wnt信号的负调控因子，因为它们隔离细胞质β-连环蛋白。在这里，我们利用EMT的两种模型：MDCK细胞的肝细胞生长因子（HGF）治疗和胚胎发育中的原肠胚形成，探讨EMT时细胞变化如何影响β-catenin的信号传递能力。我们表明，EMT不仅在钙粘蛋白内化后提供信号竞争性β-连环蛋白库，而且还显著促进Wnt通路对Wnt信号和外源性β-连蛋白的激活。我们进一步证明，细胞质中β-catenin的可用性并不一定与Wnt/β-caterin途径的活性相关，因为尽管细胞质中存在β-catening，但阻断内吞或耗尽内源性钙粘蛋白会消除途径的激活。最后，我们提供的数据表明，钙粘蛋白是体内Wnt/β-catenin通路增强激活所必需的。这表明钙粘蛋白在β-连环蛋白依赖的转录中起着关键作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。与上皮细胞相比，间充质细胞表现出强烈的Wnt转录反应。
（A） 用250 ng/ml HGF或Wnt3a条件培养基处理的HEK293和MDCK细胞或转染β-catenin的细胞进行TOPflash报告试验。HGF导致MDCK细胞中TOPflash轻度激活。相对于MDCK细胞，HEK293细胞的Wnt转录读数增强。（B–D）HEK293细胞（B）、MDCK细胞（C）和用HGF处理16小时的MDCK电池的外观（D）。经HGF处理后，MDCK细胞分散并采用类似于HEK293细胞的间充质形态。比例尺；50微米。（E） 单用HGF或Wnt3a处理的MDCK细胞中的TOPflash报告试验，或在暴露于Wnt3a前用HGF8小时预处理的MDCK细胞中的报告试验。HGF处理增强Wnt3a的转录反应。（F） 收获前16小时，用HGF处理的MDCK细胞或单独转染β-catenin或转染β-catenin并用HGF-处理的MDCK细胞进行TOPflash报告分析。HGF治疗可增强转染β-连环蛋白的转录反应。
图2
图2。HGF诱导的MDCK细胞EMT可诱导β-catenin的重新分布，并激活Wnt应答基因。
（A-F）如图所示，经HGF处理后，MDCK细胞的共焦显微镜显示β-catenin（红色）、E-cadherin（绿色）和细胞核（蓝色）。在没有HGF（A，B）的情况下，β-catenin主要与E-cadherin共存于细胞膜。HGF治疗导致细胞（C-F）扁平化和扩散，以及β-catenin和E-cadherin的内化。虽然E-cadherin和β-catentin主要定位于核周区域，但它们并没有严格的共定位，内化的E-cadherin呈点状分布，而β-catenin分布相对广泛。比例尺，20µm。（G） 用HGF处理MDCK细胞后细胞溶质和膜组分的Western blot分析。在未经处理的MDCK细胞中，β-catenin以低水平存在于细胞溶质部分，并且通过HGF处理而增加。E-钙粘蛋白仅在膜组分中检测到，转铁蛋白受体（负荷控制）也是如此。在HGF处理后，膜部分中E-钙粘蛋白的量持续增加。β-微管蛋白是细胞溶质部分的负荷控制因子。（H） MDCK细胞的Western blot分析表明，在没有和存在环己酰亚胺（CHX）的情况下，细胞溶质β-catenin对HGF的反应都增加。（I） 如定量PCR所示，在不存在和存在环己酰亚胺（CHX）的情况下，通过HGF处理4小时，Wnt靶基因（转染的TOPflash报告基因和内源性靶MMP-13）的相对水平增加。在无CHX的条件下，P（P）-值为P（P）MMP13和P（P） = TOPflash荧光素酶为0.046。在CHX条件下，P（P）<1×10−5对于MMP-13，P（P）TOPflash荧光素酶<0.002。
图3
图3。HGF对β-catenin信号的刺激依赖于内吞作用。
（A） 用HGF和增加Dynasore（50、100、200和400µM）剂量治疗6和16小时后，对MDCK细胞的细胞溶质部分进行的Western blot分析表明，HGF使细胞溶质β-catenin的积累呈剂量依赖性减少。（B） 用HGF和Dynasore（100和400µM）处理30分钟后，对MDCK细胞的细胞溶质部分进行Western blot分析。Dynasore阻断内吞作用不会干扰HGF信号诱导的Erk（p-Erk）磷酸化。（C–H）MDCK细胞的共焦显微镜显示，在用不含或含Dynasore（400µM）的HGF治疗16小时后，E-cadherin（绿色）和β-catenin（C、E、G中为红色）或转铁蛋白受体（D、F、H中为红色。在缺乏HGF或Dynasore（C，D）的情况下，β-catenin和E-cadherin定位于细胞膜（C，也如图2A，B所示），而转铁蛋白受体主要位于皮层下区域（D）。HGF治疗（E，F）导致β-catenin和E-cadherin的内化（E，也如图2E，F所示），并使转铁蛋白受体移动到核周位置，与内化的E-cadherin（F）共定位。在Dynasore的存在下，HGF诱导β-catenin和E-cadherin内化的能力被破坏，它们都留在细胞膜（G）上。比例尺；20微米。（一） 在没有或存在Dynasore（400µM）的情况下，使用对照（c）或β-catenin（β-cat）转染和HGF治疗（类似于图1F）对MDCK细胞进行TOPflash报告分析。在Dynasore存在的情况下，HGF和HGF加β-catenin的Wnt通路读数均减少。将HGF和Dynasore添加到转染细胞中，进行最后16小时的培养。所有数据均归一化为不含Dynasore的对照组。（J–L）转染标记β-连环蛋白（红色）的MDCK细胞的共焦显微镜，如图所示用HGF和Dynasore处理，用DAPI（蓝色）复染。在缺乏HGF（J）的情况下，外源性β-catenin定位于细胞膜，而HGF处理的细胞在细胞质中显示外源性β-catenin，无论是在缺乏Dynasore（K）还是存在Dynasory（L）的情况。比例尺；20微米。（M） 使用β-catenin转染和HGF和Dynasore（200µM）处理对MDCK细胞进行TOPflash报告分析。在适用的情况下，首先将HGF添加到细胞中24小时，使细胞成为间充质细胞，然后再添加Dynasore 16小时（总共40小时HGF）。Dynasore可减弱间质转化细胞中转染的β-连环蛋白的作用*P（P） = 0.011. （N） 示意图总结了β-连环蛋白活性形式释放到胞浆中的要求。
图4
图4。一种不定位于细胞膜的β-连环蛋白表现出低转录活性。
（A） 转染的Flag标记的野生型β-连环蛋白（WT）和各种突变形式的MDCK细胞的荧光显微镜免疫染色。由抗Flag抗体检测到的外源性β-catenin定位于细胞膜，但Y654E突变体除外，该突变体呈细胞质分布。比例尺，20µm。（B） 与（A）类似的分析，与E-cadherin（红色）和细胞核（蓝色）共同染色。野生型β-catenin与E-cadherin共定位，而Y654E没有。比例尺，20µm。（C，D）TOPflash报告分析MDCK细胞中的β-catenin突变体，在培养基中不含（C）或含（D）HGF。在未经HGF处理的情况下，对照转染对照DNA的细胞的折叠激活正常化。除Y654E外，所有结构体的转录激活都相似，Y654E的转录读数大大减少(*P（P）<2×10−7与其他β-catenin结构相比）。
图5
图5。钙粘蛋白是Wnt3a和β-catenin转录激活所必需的。
（A–D）未经四环素诱导E-cadherin shRNA表达（对照，−Tet）或（+Tet）的MDCK细胞的共焦显微镜，在不使用或使用HGF治疗后，对β-catenin进行染色。（C）和（D）（C′，D′）中的插入物是myc标记检测到的外源性β-catenin。对于存在E-cadherin的外源性β-catenin，见图3J，K。E-cadherin-depleted细胞不会被HGF散射，大部分β-catentin仍留在细胞膜上，而少数以间断方式分布在细胞质中。转染的β-catenin在没有HGF（C′）的情况下定位于细胞膜，而在有HGF的情况下分布于细胞质，类似于E-cadherin阳性MDCK细胞（见图3J，K）。比例尺，20µm。（E） MDCK细胞（对照，−Tet）或耗尽E-cadherin（E-cadherin-shRNA，+Tet）的MDCK电池中的TOPflash报告分析。用TOPflash报告基因转染的细胞要么用Wnt3a培养基处理，要么用β-catenin联合转染。用HGF处理细胞可增强细胞对Wnt3a或β-catenin的反应，如图1E和1F所示。在缺乏E-cadherin的细胞中，HGF不能增强对Wnt3a和β-catenin的反应。（F） Western blot分析MDCK细胞膜（上两行）和细胞溶质（下四行）部分，不诱导或诱导E-cadherin shRNA表达，不诱导和诱导HGF。一些细胞组用Wnt3a条件培养基或2µM BIO（GSK3β抑制剂）处理，或用myc标记的β-catenin转染，如顶部所示。膜组分分析表明，E-cadherin shRNA完全消除了E-cadherin蛋白。用抗活性β-连环蛋白（ABC）和抗β-连环素（总）抗体分析细胞溶质部分，并用抗myc抗体检测外源性β-连链蛋白，用抗β-微管蛋白控制负荷。用A431人癌细胞裂解液作为抗活性β-连环蛋白抗体的阳性对照。在所有实验组中，当E-cadherin表达保持不变时，活性-β-catenin对HGF的反应增加。相反，在缺乏E-cadherin的情况下，HGF增加活性-β-catenin的能力被取消。注意，ABC抗体也检测到myc标记的β-catenin，其大小大于内源性β-catentin，对HGF和E-cadherin丢失的反应类似于Wnt3a或BIO处理的内源性β-catenin。用TOPflash报告子和β-catenin（β-cat）或稳定形式转染细胞，其中GSK3β靶点的四个丝氨酸和苏氨酸残基突变为丙氨酸（β4A）。与β-catenin类似，无论是否存在HGF，β4A构建物在E-cadherin缺失细胞中均未显示报告基因的任何显著激活。
图6
图6。N-钙粘蛋白缺失的小鼠胚胎在EMT期间表现出低Wnt通路活性和下游靶基因表达降低。
（A） 转染对照或N-钙粘蛋白siRNA的HEK293细胞膜部分的Western blot分析。转铁蛋白受体作为负荷对照。N-钙粘蛋白siRNA减弱N-钙粘蛋白的表达。β-catenin也略有减少。（B） 转染N-钙粘蛋白siRNA后，在HEK293细胞中进行TOPflash报告基因测定。用对照培养基（C）或Wnt3a培养基（W）处理细胞，或用β-连环蛋白（β）转染细胞。N-cadherin siRNA减弱β-catenin转染的效果*P（P）<1×10−6（C–F）TOP-LacZ报告小鼠胚胎，8.5 dpc，具有野生型（+/+）或缺失型（−/−）N-cadherin基因型。报告基因表达是通过针对LacZ的原位杂交探针检测的。在后部原始条纹的水平上（C，D中的箭头），报告基因在−/−突变体中的表达较弱，而中脑（短箭头）和前部体节（长箭头）的表达水平相当。（E） 和（F）分别是（C）和（D）的横截面，位于原始条纹（箭头）的水平，外胚层细胞在中线分层并侧向迁移形成中胚层。（G–J）8.25 dpc的野生型（G，I）或N-钙粘蛋白−/−（H，J）基因型小鼠胚胎，用Tbx6型，Wnt信号靶基因，通过RNA原位杂交。（G） 和（H）是后部开放性神经板区域的特写。N-cadherin突变胚胎的Tbx6表达较弱。箭头所示水平的横截面如I和J所示Tbx6型与野生型相比，N-cadherin−/−胚胎中分层的中胚层细胞中的含量显著降低。比例尺，100µm。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“引用者”文章

工具书类

    1. Willert J，Epping M，Pollack JR，Brown PO，Nusse R.人类胚胎癌细胞对Wnt蛋白的转录反应。BMC开发生物。2002;2:8.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gottardi CJ，Gumbiner BM。β-catenin的不同分子形式以粘附或转录复合物为靶点。细胞生物学杂志。2004;167:339–349.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bienz M.β-连环蛋白：细胞粘附和Wnt信号之间的枢纽。当前生物量。2005;15:R64–67。-公共医学
    1. Gumbiner BM。钙粘蛋白粘附活性的调节。细胞生物学杂志。2000;148:399–404.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Harris TJ，Peifer M.决策：β-catenin在粘附和转录之间进行选择。趋势细胞生物学。2005;15:234–237.-公共医学

出版物类型

MeSH术语

赠款和资金