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.2012年2月；22(2):399-412.
doi:10.1038/cr.2011.145。 Epub 2011年8月30日。

K-ras（G12V）转化导致线粒体功能障碍和从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转换

胡玉敏 1, 魏勤路, 陈刚（音译）, 王鹏（音译）, 赵晨, 兖州, 小笠原（Marcia Ogasawara）, Dunyaporn Trachootham公司, 李峰, 海伦·佩利卡诺, 保罗·焦立中, 迈克尔·基廷, 吉列尔莫·加西亚·马内罗, 黄鹏
附属公司

K-ras（G12V）转化导致线粒体功能障碍和从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转换

胡玉敏等。 单元格Res. 2012年2月.

摘要

有氧糖酵解和氧化应激增加是癌细胞代谢的重要特征，但其潜在的生化和分子机制尚不清楚。使用四环素诱导模型，我们表明K-ras（G12V）的激活导致线粒体功能障碍，导致呼吸减少、糖酵解升高和活性氧生成增加。K-RAS蛋白与线粒体相关，通过影响环孢素敏感的通透性转换孔，诱导呼吸链复合物I的快速抑制和线粒体跨膜电位的降低。此外，体外预诱导K-ras（G12V）表达以允许代谢适应高糖酵解代谢，可增强转化细胞在体内形成肿瘤的能力。我们的研究表明，诱导线粒体功能障碍是K-ras（G12V）引起癌细胞代谢变化和ROS应激，促进肿瘤发展的重要机制。

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数字

图1
图1
K-ras公司G12伏激活导致线粒体功能障碍。（A）20 ng/ml多西环素以时间依赖性方式诱导T-Rex/K-ras细胞异位K-ras表达。在T-Rex/病媒控制细胞中，同样的强力霉素治疗没有引起显著变化。K-ras蛋白表达G12伏用K-ras特异性抗体免疫印迹法检测。β-肌动蛋白作为负荷对照。（B）用荧光探针Rho-123测量强力霉素诱导K-ras 24小时后T-Rex/K-ras线粒体跨膜电位的损失。相同浓度的强力霉素对载体控制细胞的跨膜电位没有影响。（C）K-ras激活导致线粒体跨膜电位下降，呈时间依赖性。诱导细胞的跨膜电位水平归一化为未诱导细胞的水平。（D）24小时（Tet/on）和（Tet/off）K-ras激活的T-Rex-293细胞的耗氧率。（E）K-ras活化以时间依赖的方式抑制氧消耗。（F）K-ras激活不影响线粒体DNA含量。（G）K-ras激活对膜联蛋白V-PI测定的细胞活力的影响。中的数据C类和E类显示为平均值±SD。n个= 3,*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.01.
图2
图2
K-ras诱导的线粒体功能障碍G12伏激活导致代谢改变。（A）分析线粒体复合物I和II活性的实验原理以及K-ras诱导48小时前后T-Rex-293细胞的代表性耗氧曲线。数字表示线粒体复合物I-IV和II-IV的耗氧速率（nmol/ml/min）。箭头表示添加试剂的时间点。鱼藤酮：100 nM；洋地黄素：30μg/ml；琥珀酸盐：5μM。（B）K-ras诱导后复合物I-IV和II-IV耗氧率的定量分析。数据为平均值±标准偏差。n个= 3,*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.01.（C）K-ras公司G12伏诱导导致线粒体呼吸链复合物I 20 kD（Com I 20 kD）亚基减少，复合物II 30 kD（Com II 30 kD）亚基增加，磷酸化Akt（S473). 诱导24小时后SOD2和过氧化氢酶也被抑制。（D）通过荧光探针DCF-DA测量，K-ras激活48小时后，ROS生成显著增加。（E）K-ras激活以时间依赖性的方式导致ROS生成增加。（F）K-ras活化对耗氧、葡萄糖摄取和乳酸生成的影响。在K-ras诱导24小时和72小时后测量代谢参数。
图3
图3
K-RAS蛋白向线粒体的转运及其在导致线粒体功能障碍中的作用。（A）在强力霉素诱导12小时前后，从T-Rex细胞中分离出线粒体部分。分析细胞液和线粒体（Mito）的蛋白裂解物中是否存在K-ras。HSP60和微管蛋白分别作为线粒体和细胞溶质标志物。（B）用K-ras从T-Rex细胞中分离线粒体G12伏诱导（对照）用100μg/ml胰蛋白酶在4°C、24°C和37°C下处理30分钟。Western blotting分析显示K-ras、己糖激酶II（HKII）和细胞色素c。（C）K-ras定位的共焦显微镜分析。如材料和方法中所述，在K-ras诱导12 h前后用MitoTracker Red、K-ras-FITC（绿色）和DAPI标记HEK293细胞的细胞核（蓝色）。（D）对来自T-Rex细胞的线粒体裂解物进行免疫印迹，该细胞未经强力霉素诱导（第1道），强力霉素诱发12小时（第2道），以及强力霉素诱生加25μM h-7（第3道）。PKC抑制剂H-7部分阻止了K-ras向线粒体的转移。（E）与对照组相比，K-ras激活（Tet/on）导致线粒体跨膜电位降低50%。同时治疗H-7（+H-7）可挽救跨膜电位的降低。（F）用5μM环孢霉素A（on+CysA）治疗可缓解K-ras引起的跨膜电位下降。（G）定量分析存在或不存在环孢菌素A时K-ras表达细胞的跨膜电位。数据显示为平均值±SD。n个= 3,*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.01.
图4
图4
K-ras的可逆性G12伏-诱导活性氧生成和线粒体功能障碍。（A）用20 ng/ml多西环素处理T-Rex细胞24小时（Tet/on），然后退出细胞培养1、2和3天。通过蛋白质印迹分析测定K-ras、SOD2、过氧化氢酶和β-肌动蛋白的表达。（B）K-ras诱导（Tet/on）导致ROS增加。去除强力霉素2天可逆转活性氧的增加。（C）K-ras诱导导致线粒体跨膜电位降低。去除强力霉素2天后，与对照组（Tet/off）相比，这种下降逆转至基线水平。（D）不含K-ras的HEK293细胞的形态学G12伏表达（Tet/off），带有K-rasG12伏表达1天（Tet/on），停药2天后。
图5
图5
K-ras长期表达的影响G12伏细胞代谢和肿瘤形成能力。（A）用20 ng/ml多西环素连续培养1个月以上，诱导T-Rex/K-ras细胞表达K-ras。与Tet/off对照细胞比较，测量耗氧量、葡萄糖摄取量和乳酸生成量。（B）对长期表达或不表达K-ras的T-Rex/K-ras细胞中的Akt和己糖激酶II（HKII）进行Western blot分析。（C）比较Tet/off和长期Tet/on细胞中的线粒体质量，用MitoTracker Green染色后通过流式细胞术分析测量。（D）诱导K-ras后活性氧的生成保持升高G12伏超过一个月（长期Tet/on）。（E）不含或含K-ras的T-Rex/K-ras细胞中谷胱甘肽（GSH）水平的分析G12伏短期（48小时）和长期（>1个月）诱导。（F）长期预诱导K-ras前后T-Rex/K-ras细胞的比较G12伏用于软琼脂中的菌落形成。将相同数量的细胞接种在软琼脂悬浮液中的六孔板中，如材料和方法所述。培养15天后，菌落用碘硝丙唑紫染色并计数。数据显示为三次试验的平均值±SD。（G）有代表性的小鼠显示肿瘤是从接种的T-Rex/K-ras细胞生长而来的。有或无K-ras长期预诱导的细胞G12伏将表达产物分别接种到同一小鼠的左侧和右侧。（H）长期预诱导和不诱导K-ras的T-Rex/K-ras细胞荷瘤小鼠肿瘤生长的比较G12伏表达式。细胞接种后，所有小鼠在60天的观察期内均接受强力霉素治疗。
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中的注释

  • K-Ras和线粒体：危险的联系。
    Neuzil J、Rohlena J、Dong LF。 Neuzil J等人。 Cell Res.2012年2月；22(2):285-7. doi:10.1038/cr.2011.160。Epub 2011年9月27日。 2012年细胞研究。 PMID：21946499 免费PMC文章。

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