Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling

doi:10.1016/j.freeradbiomed.2011.08.005

.2011年11月1日；51(9):1621-35.

doi:10.1016/j.freeradbiomed.2011.08.05。 Epub 2011年8月16日。

通过代谢谱评估氧化应激反应中的生物能量功能

布莱恩·德兰卡¹, 格洛丽亚·贝纳维德斯, 安妮·迪尔斯, 萨曼莎·佐丹奴, 布莱克·塞利克森, 科林·赖利, 邹鲁云, 约翰·查塔姆, 布拉德福德·G·希尔, 张建华, 艾梅·兰德尔, 维克多·M·达利-美国

附属公司

PMID： 21872656
预防性维修识别码：项目经理3548422
内政部： 2016年10月10日/j.freeradbiomed.2011.08.05

通过代谢谱评估氧化应激反应中的生物能量功能

布莱恩·德兰卡等。自由基生物医学. 2011.

.2011年11月1日；51(9):1621-35.

doi:10.1016/j.freeradbiomed.2011.08.05。 Epub 2011年8月16日。

作者

附属

¹美国阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学病理学系和自由基生物学中心，邮编35294。

PMID： 21872656
预防性维修识别码：下午548422
内政部： 2016年10月10日/j.freeradbiomed.2011.08.05

摘要

现在很清楚，线粒体是氧化应激在多种病理中的重要靶点，包括心血管疾病、糖尿病、神经退行性变和癌症。评估反应物对分离线粒体影响的方法已经建立，但由于需要大量材料来制备完整线粒体以进行极谱测量，因此受到了限制。利用高分辨率极谱和荧光技术测量溶液中的氧浓度，可以测量完整细胞的线粒体功能。最近，开发了细胞外通量方法来同时监测多个样品井中粘附细胞培养物中氧浓度和pH的变化，这大大增强了测量生物能量功能以响应氧化应激的能力。在这里，我们使用肾脏、心血管、神经和致瘤模型系统的代表性细胞类型详细描述了这些方法，同时说明了三种方案的应用，以分析细胞对氧化应激的生物能量反应。

PubMed免责声明

数字

**图1。评估完整细胞线粒体功能的三种方案**
线粒体功能评估通常使用三种方法之一进行。方案1：建立基线OCR后，注入感兴趣的化合物。然后随着时间的推移，对OCR和ECAR的影响进行监测。方案2：建立基线后，注射感兴趣的化合物，在预定的时间内监测OCR和ECAR，然后评估线粒体功能。方案3：在仪器外完成感兴趣化合物的治疗。然后将细胞洗去应激源，直接评估线粒体功能。

**图2。HNE对培养细胞的急性作用**
HNE对OCR和ECAR的影响使用协议1型策略进行评估。A组：在建立接种至75000个细胞/孔的NRVM的基线OCR后，将HNE注射至最终浓度为5μM（开方格，实线）或20μM（闭方格，虚线）。对OCR的影响再观察4小时。B组：与A组相同，只是测量了ECAR。C组：以30000个细胞/孔接种MES-13，建立基线OCR，然后在5μM（开方格，实线）或20μM（闭方格，虚线）注射HNE，OCR持续2小时。D组：与E组相同，但测量ECAR除外。E组：在分化的SH-SY5Y细胞中建立基线OCR后，注射HNE至0、10、15或20μM的最终浓度。对OCR的影响再观察2小时。面板F：与面板E相同，只是测量了ECAR。小组G：NRVM暴露于5、10或20μM HNE中1小时。OCR和ECAR从此单一时间点相互绘制。H组：MES13细胞暴露于5或20μM HNE 1小时。从这个单一时间点开始，OCR和ECAR相互对比绘制。第一组：分化的SH-SY5Y细胞暴露于10、15或20μM HNE中1小时。从这个单一时间点开始，OCR和ECAR相互对比绘制。显示的所有数据均为每个治疗组的平均值±sem.n≥3。为了清楚起见，省略了统计显著性。如果错误条不可见，则它们小于数据点符号。面板A、B和G中的数据改编自[40]。

**图3。XF代谢分析与蛋白质印迹的整合**
在RASMC中进行OCR测量后，检查HNE对线粒体功能、蛋白质修饰和HO-1诱导的影响。图A：在急性暴露于0、0.5和5μM HNE后，测量大鼠主动脉平滑肌细胞的OCR。然后在指定的时间内检查OCR。B组：实验结束时，在含有洗涤剂的缓冲液中溶解细胞（如文中所述），用SDS-PAGE分离蛋白质，然后对蛋白质-HNE加合物和HO-1进行蛋白质印迹。然后将PVDF膜上的抗体剥离，并用Amido Black（在40%甲醇和10%乙酸中的0.1%萘酚蓝黑）染色。然后用40%的甲醇和10%的乙酸对PVDF进行脱色，以观察分离的蛋白质。C组和D组：HO-1表达（C组）和蛋白-HNE加合物（D组）被量化并归一化为Amido Black蛋白染色。n=每组3个；*，与未经HNE处理的细胞相比，p≤0.05。

**图4。线粒体功能的Protocol-2型分析原理**
面板A描述了执行协议2型实验的方法。B组：用于评估应激源对线粒体功能的急性影响的线粒体功能测定的典型特征。示例数据来自控制BAEC。建立基线OCR后，注入感兴趣的压力源并监测所需的时间。这可以确定压力源对OCR的直接影响。然后按所述进行线粒体功能测定。指出了可以使用此方法计算的各个参数。C组：将BAEC接种到40000个细胞/孔，并让其孵育24小时。然后，在注射最终浓度为250或500μM的Deta NONOate之前，测量基础OCR。让细胞孵育1小时，然后再进行3次OCR测量。随后依次注射寡霉素（1μg/ml）、FCCP（1μM）和抗霉素A（10μM）。D组：根据C组的数据，可以计算线粒体的储备容量。面板C和D中显示的数据表示每个治疗组的平均值±sem.n≥3。*，与0μM Deta NONOate对照品相比，p≤0.05。小组C和D改编自自由基生物学和医学，v.48（7），Dranka BP等人，内皮细胞线粒体储备能力：一氧化氮和活性氧物种的影响，p.905-14，版权所有（2010），经爱思唯尔许可。

**图5。HNE对线粒体功能的影响因所研究的细胞系而异**
采用方案2策略，在NRVM（面板a和B）、MES13（面板C和D）和SH-SY5Y（面板E和F）中检测HNE对线粒体功能的影响。A组：确定基线后，将HNE注射到NRVM培养物中，最终浓度为5、10或20μM。30分钟后进行最后一次基础OCR测量，称为HNE后OCR。随后进行所述的线粒体功能测定。B组：根据A组所示数据计算的单个线粒体功能参数。C组：与A组相同，但实验是在SH-SY5Y细胞中进行的。D组：根据C组所示数据计算的单个线粒体功能参数。E组：与A组相同，但实验是在MES-13细胞中进行的。面板F：根据面板E中显示的数据计算出的单个线粒体功能参数。所有显示的数据均为平均值±sem。如果误差条不可见，则它们小于数据点符号。每个治疗组n≥3。*，与相应的对照测量值相比，通过双尾非配对t检验确定p≤0.05。

**图6。DMNQ对内皮线粒体功能的影响**
使用协议2策略，在BAEC中检查氧化还原循环化合物DMNQ的作用。建立基线OCR后，注射DMNQ至最终浓度15μM。图A描述了对线粒体功能的影响。然后根据这些数据计算出的基本OCR绘制为DMNQ浓度的函数（面板B）。根据面板A中显示的数据，可以确定线粒体功能的各个参数（面板C）。在一些实验中，在注射DMNQ时添加DPI（10μM）。DMNQ模拟的OCR如面板D所示。所示的所有数据均为平均值±sem。每个治疗组n=5。*，与相应的对照测量值相比，通过双尾非配对t检验确定p≤0.05。面板A和B改编自自由基生物学和医学，v.48（7），Dranka BP等人，内皮细胞线粒体储备能力：一氧化氮和活性氧物种的影响，p.905-14，版权所有（2010），经爱思唯尔许可。

**图7。氧化应激源的影响可能会持续到清除之后**
使用方案3风格的方法，在预处理一段时间的各种细胞系中测试氧化应激源的影响。在每一种情况下，在评估线粒体功能之前，应清除应激源。面板A描述了执行协议3式实验的方法。B组：将NRVM接种到75000个细胞/孔，持续24小时。然后用50μM h的药丸处理一些细胞₂O（运行）₂在使用1μg/ml寡霉素、1μM FCCP和10μM抗霉素A评估线粒体功能之前，清洗细胞并将其更换为分析培养基1小时。C组：根据B组数据计算的单个线粒体功能参数。所示数据为每个治疗组的平均值±sem.n≥3。D组：用10μM 15d-PGJ处理MDA-MB231细胞30分钟₂（15天），米托-15d-PGJ₂（线粒体-15d）或线粒体-PGE₂如前所述评估线粒体功能。确定基线后，依次注射寡霉素（0.3μg/ml）、FCCP（1μM）和抗霉素A（10μM）来测定线粒体功能参数。*，与对照细胞相比，p≤0.05。#，与非靶向15d-PGJ相比，p≤0.05₂处理过的细胞。结果表示平均值±sem，n=5。

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1. 品牌MD、Nicholls DG。评估细胞线粒体功能障碍。《生物化学杂志》2011；435:297–312.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Clark LC，Jr.、Wolf R、Granger D、Taylor Z。极谱法连续记录血氧张力。应用物理学杂志。1953;6:189–193.-公共医学
1. Li AE，Ito H，Rovira II，Kim K-S，Takeda K，Yu Z-Y，Ferrans VJ，Finkel T.活性氧在内皮细胞Anoikis中的作用。1999年Circ Res；85:304–310.-公共医学
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