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.2011年9月2日；146(5):772-84.
doi:10.1016/j.cell.2011.07.033。 Epub 2011年8月25日。

低氧诱导因子1对T（H）17/T（reg）平衡的控制

埃里克·V·当 1, 约瑟夫·巴比, 黄玉阳, 迪利尼·吉纳塞纳, 洪宇, 应征, 扎卡里·博德曼, 胡安·傅, 年轻的金, 颜宏融, 罗微, 凯伦·泽勒, 拉里萨·西蒙达, 苏珊娜·托帕利安, 格雷格·塞门扎, 池V当, 德鲁·M·帕多尔, 风扇盘
附属公司

低氧诱导因子1对T（H）17/T（reg）平衡的控制

埃里克·V·当等。 单元格. .

摘要

T细胞分化为不同的功能效应器和抑制亚群在一定程度上受到抗原识别时存在的细胞因子环境的调节。在这里，我们发现低氧诱导因子1（HIF-1）是一种关键的代谢传感器，调节调节性T细胞（T（reg））和T（H）17分化之间的平衡。HIF-1通过直接转录激活RORγT和通过三级复合物形成增强T（H）17的发育，RORγT和p300招募到IL-17启动子，从而调节T（H）17特征基因。同时，HIF-1通过结合Foxp3并将其靶向蛋白酶体降解来减弱T（reg）的发育。重要的是，这种调节在常压和缺氧条件下都会发生。HIF-1α缺乏T细胞的小鼠对T（H）17依赖性实验性自身免疫性脑炎的诱导具有抵抗力，该脑炎与T（H）17减少和T（reg）细胞增加相关。这些发现突出了代谢线索在T细胞命运决定中的重要性，并表明代谢调节可以改善某些基于T细胞的免疫病理。

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数字

图1
图1。HIF-1αmRNA在T细胞中表达上调H（H）17个与Stat3相关的倾斜条件
（A） 天真（CD4+CD25-CD62L高的)T细胞在Th细胞亚群诱导条件下培养，用qRT-PCR检测HIF-1 mRNA。野生型（WT，HIF-1α）的（B，C和D）幼稚T细胞+/+)或CD4细胞Cre公司x高强度聚焦因子-1flox/flox公司小鼠（ko，HIF-1α−/−)β和IL-6的存在下受到刺激。从这些细胞中分离RNA，在培养过程中的不同时间点进行qRT-PCR，以测量HIF-1α（B）、IL-17（C）和RORγt（D）转录水平。（E） WT或Stat3−/−（来源：CD4细胞Cre公司x统计3flox/flox公司在指定的条件下分离和培养小鼠幼稚CD4+T细胞2天，然后分别使用抗HIF-1α（顶部）、HIF-1β（中部）和微管蛋白（底部）抗体进行SDS-PAGE和Western blotting。（F） 采用ChIP分析检测Stat3与HIF-1α启动子的直接结合。面板A–D和F描述了至少三个实验的平均值+s.D.，而面板E是一个具有代表性的结果。另请参见图S1。
图2
图2。T需要HIF-1αH（H）17开发在体外
（A） 从野生型（WT，HIF-1α）分离的幼稚T细胞+/+)或CD4细胞Cre公司x高强度聚焦因子-1αflox/flox公司（HIF-1α−/−)小鼠在TH（H）17种抗CD3/CD28和TGFβ、IL-6和抗IFNγ、IL-12和IL-4抗体的倾斜条件持续6天。然后对细胞进行IL-17和Foxp3染色（见方法）。数字表示CD4+细胞对所示标记呈阳性的百分比。（B） 从WT或T-HIF-1α−/−小鼠中激活FACS分类的原始CD4+T细胞，并在TH（H）17倾斜4天。分离总RNA，通过qRT-PCR评估IL-17、IL-17F和IL-23R基因的mRNA表达。对于每个基因，HIF-1−/−T细胞中的表达水平设置为1。显示了至少3次试验的平均值+标准差。（C） 在中性（抗IL-4和抗IFNγ-Ig）或TH（H）17-倾斜条件下，用表达HIF-1α-GFP或GFP的双顺反子逆转录病毒转导。对GFP+细胞中的细胞内细胞因子进行染色和分析。数字表示门控GFP+细胞的百分比。（D） 从WT或T-HIF-1α−/−小鼠分离的幼稚T细胞在常氧或缺氧条件下被激活，如（A）所述（见方法）。面板C和D代表至少2个独立实验。另请参见图S2。
图3
图3。HIF-1α反式激活RORγt转录，是RORγt-驱动tH（H）17分化在体外
（A） Jurkat T细胞在野生型RORγT启动子或具有突变HIF-1结合位点的启动子控制下与荧光素酶报告子共同转染。转染后24小时，用PMA和离子霉素处理细胞，或在分析萤光素酶活性之前不处理细胞，将其标准化为雷尼拉萤光素酶的活性。（B） 将RORγT-荧光素酶报告质粒（包含RORγT启动子）与编码野生型HIF-1或HIF-1突变体（DNA结合域缺失）的质粒一起转染Jurkat T细胞。转染24小时后，刺激细胞并按（A）所述评估荧光素酶活性。显示了三个独立实验的数据（三次转染的平均值和标准差）。（C） 采用ChIP法直接测定HIF-1与RORγt启动子的结合。（D和E）原始WT或HIF-1−/−在中性（抗IL4和抗IFNγ）条件下，用抗CD3/抗CD28激活CD4+T细胞，并用表达RORγT-GFP的双顺反子逆转录病毒或含有空载体的GFP转导。细胞内IL-17和Foxp3染色。图中所示为GFP+细胞的门控图。这些实验至少重复了两次，结果一致。另请参见图S3。
图4
图4。RORγt、HIF-1α和p300结合IL-17启动子调控其基因表达
（A） HIF-1α突变体（HIF-1-ΔDBD，DNA结合域被删除）在存在RORγt的情况下保持激活IL-17启动子驱动的荧光素酶活性的能力。用IL-17启动子驱动的荧光素酶报告子和所示质粒转染Jurkat T细胞，然后进行刺激和评估，如图3A所示。数据代表至少3个实验（三次转染的平均值和s.d.）。（B） 用免疫共沉淀法检测HIF-1与RORγt的相互作用。FACS分类的CD4+T细胞在TH（H）17-倾斜条件5天。用抗RORγt抗体（左面板）或抗HIF-1α抗体（右面板）免疫沉淀整个细胞裂解物，用SDS-PAGE溶解并用指示的抗体进行印迹。（C） RORγt与HIF-1的N末端相互作用。纯化的His-tagged RORγt大肠杆菌与GST-HIF-1的不同片段孵育，也从大肠杆菌如图所示，然后用GST珠下拉，用SDS-PAGE和Westen印迹法用抗RORγt（顶部和底部）抗体或抗GST（中间）进行分辨。来自WT或HIF-1−/−小鼠的（D和E）FACS分类的CD4+T细胞在TH（H）17-收获前使用抗RORγt、抗HIF-1或抗p300抗体进行ChIP分析的倾斜条件（如B所述）。（F） 缺氧通过HIF-1、RORγt和p300增强IL-17启动子驱动的荧光素酶活性的激活。在常氧或缺氧条件下，用IL-17启动子驱动的荧光素酶报告子和所示质粒转染Jurkat T细胞，然后进行刺激和评估，如图3B所示。数据代表至少3个独立实验（三次转染的平均值和标准差）。（G） 通过ChIP分析，在TH（H）17个倾斜条件持续5天。另请参见图S4–S6和表S1。
图5
图5。HIF-1α通过蛋白酶体降解途径介导Foxp3降解
（A） 对来自WT或T-HIF-1−/−小鼠的原始T细胞进行培养，并在TGFβ和IL-6的存在下进行刺激，并在不同时间进行qRT-PCR以测量Foxp3 mRNA。（B） HIF-1α−/−T细胞在在体外Treg分化。通过FACS分离HIF-1+/+和T-HIF-1−/−的原始T细胞，并在Treg偏斜下激活（5ng/ml TGFβ，100U IL-2）。72小时后对细胞进行Foxp3染色。所示为三个实验中HIF-1+/+（红线）和HIF-1−/−（蓝线）细胞的代表性直方图。同型控件显示为绿色。数字表示Foxp3+细胞的平均百分比。（C） Foxp3蛋白在用IL-6培养WT T细胞时丢失，但在HIF-1α−/−Foxp3+T细胞中保持不变。用指定剂量的IL-6在Treg倾斜（TGFβ，5ng/ml）下激活幼稚T细胞4天。Western blotting检测Foxp3蛋白水平。（D） 在体外分化过程中，低氧降低了幼稚T细胞Foxp3的表达。从Foxp3-GFP报告小鼠（CD4+GFP-CD62L高的)在Treg倾斜条件下（见B）在缺氧室或常压下培养（分别为蓝线和红线）。数字表示三个实验中表达GFP（Foxp3+）的CD4+细胞的平均百分比。（E） HIF-1在iTreg细胞中与Foxp3相互作用。激活FACS分类的CD4+T细胞并在iTreg倾斜下培养4天。用抗HIF-1抗体（左图）或抗Foxp3抗体（右图）免疫沉淀细胞裂解物，然后进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。（F，G和H）HIF-1α介导Foxp3降解。293T细胞与Foxp3+/-ubiquitin共转染，增加WT HIF-1（F）或突变HIF-1的数量（p420A和p564A）（G）或缺失的ODD结构域（CA5-HIF）（H））。如图所示，对CoIP和Western blots进行了检测。（I和J）Naive T细胞在Treg倾斜条件下在常氧（N）或缺氧（H）条件下培养4天。收集并裂解细胞，然后用抗Foxp3或对照IgG抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE和western blot解析下拉蛋白和输入对照。描述了3个独立实验的典型结果。另见图S7
图6
图6。CD4+T细胞中缺乏HIF-1α的小鼠IL-17分泌不足，Foxp3 Treg数量增加，对EAE更具抵抗力
（A） 通过注射MOG在HIF-1+/+和T-HIF-1−/−小鼠中诱导EAE35–55CFA和百日咳毒素。每天监测疾病严重程度并进行评分。T-HIF-1−/−小鼠未能发展成HIF-1+/+小鼠所见的严重疾病。表示HIF-1+/+和T-HIF-1−/-小鼠随时间的平均得分（+/-SEM；*p<0.05）。所示为4个实验的代表（每组N=7-10）。（B，C）在疾病高峰期（第12天），恢复引流淋巴结、脾脏和CNS浸润的T细胞，并对其进行IL-17和IFNγ染色。测定了疾病高峰期（第12-14天）中枢神经系统CD4+细胞IL-17阳性的平均百分比（C）。（D和E）同样，在恢复期（第21天），分离组织浸润细胞，发现Foxp3+的CD4+百分比（D和D）。图C和E显示了至少3项试验的平均值（±SEM，*p<0.05），点图是具有代表性的分析。
图7
图7。HIF-1α调节T的多因素作用模型H（H）17/Treg天平
IL-6等因子激活Stat3转录激活HIF-1。HIF-1水平进一步受到氧张力和其他代谢物的调节，这是代谢线索和T细胞谱系承诺之间的关键分子联系。HIF-1直接激活RORγt基因转录，并将p300招募到RORγt转录复合物中，使其成为t的启动子H（H）17个基因（即IL-17）。这些活动促进Th17分化。同时，HIF-1通过靶向泛素化和蛋白酶体降解诱导Foxp3蛋白降解。
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