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.2011年8月25日；71(4):617-31.
doi:10.1016/j.neuron.2011.07.005。

用于监测和操纵特定神经回路中活动和基因表达的新型狂犬病病毒变体

大阪府 1, 森卓马, 阿里·H·塞廷, 詹姆斯·马歇尔, 比阿特丽斯·维根, 爱德华·M·卡拉威
附属公司

用于监测和操纵特定神经回路中活动和基因表达的新型狂犬病病毒变体

大阪府等人。 神经元. .

勘误表in

  • 神经元。2012年4月12日；74(1):206

摘要

糖蛋白缺失狂犬病病毒是研究神经回路结构的有力工具。在这里，我们描述了新资源的开发和应用，这些新资源允许实验直接研究神经电路的结构和功能之间的关系。新的方法和试剂可以从质粒DNA中高效生产12种新的ΔG狂犬病变异体。这些新型狂犬病病毒表达了有用的神经科学工具，包括用于监测活动的Ca（2+）指示剂GCaMP3；光激活通道视紫红质-2；配体应用失活的allotostatin受体；和rtTA、ER（T2）CreER（T2）或FLPo，用于控制基因表达。这些新工具可以根据神经元的连接性来检测神经元的功能，或控制其活动或基因表达。将这些工具与体内成像和光遗传学方法和/或转基因小鼠中的诱导基因表达相结合，将有助于研究现有试剂无法实现的神经回路发育、可塑性和功能的实验。

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数字

图1
图1。编码多基因狂犬病病毒载体的制备
（A，B）SADΔG-mCherry（A）和SAD△G-BFP（B）狂犬病病毒的产生。（A） 将SADΔG-mCherry注射到dLGN后，观察到大鼠初级视皮层第6层的神经元。（B） 大鼠视皮层2/3层和4层的神经元通过向附近的视皮层注射SADΔG-BFP进行标记。比例尺，100μm。（C） 每个开放阅读框都需要在狂犬病基因组中的开放阅读框前后插入转录起始和终止序列。为了插入额外的外源基因，在GFP的最后一个密码子与其转录结束序列之间插入带有额外转录开始和停止序列（黑色，轮廓为红色）的mCherry，然后插入mCherry。（D，E，F）感染SADΔG-GFP-mCherry的皮层切片培养中的神经元。所有感染SADΔG-GFP-mCherry的神经元均表达mCherri（D，F）和GFP（E，F），表明这两种基因产物的转录调控和表达是可靠的。比例尺，100μm。（G） 为将一个或两个转硫基因高效导入狂犬病基因组而创建的质粒。pSADΔG-F3狂犬病基因组载体有两个多克隆位点（MCS-1和MCS-2），用于插入感兴趣的基因。对于狂犬病载体中单个基因的表达，使用MCS-1中的一个位点和MCS-2中的一种位点可以插入单个ORF并删除停止和启动转录盒。为了克隆两个转基因，将每个基因插入MCS-1和MCS-2中，可以从狂犬病载体中实现可靠的共表达。
图2
图2。用表达GCaMP3的ΔG狂犬病病毒监测神经活动
（A） 纹状体和纹状体外皮质区的视网膜异位组织。来自内在成像的视网膜主题图被覆盖在表面血管的图像上。V1和AL之间的边界位置是根据垂直丁二烯的代表性（鼻腔视野）确定的，以便将病毒注射靶向AL（红色X）。将SADΔG-GCaMP3-DsRedX注射到小鼠纹状体外皮层外侧区AL，并将V1中相应的视网膜异位位置记录为逆行感染神经元的预期位置（红色方块）。（B） SADΔG-GCaMP3-DsRedX感染神经元的Z堆叠可视化体内注射狂犬病9天后，V1双光子成像。在从皮层表面延伸至1.5 mm深度的成像平面上可以看到AL投射的V1神经元胞体和突起（C）SADΔG-GCaMP3-DsRedX感染神经元的双光子激光扫描图像的俯视图，距离皮层表面370μm。V1神经元用SADΔG-GCaMP3-DsRedX逆行标记，并联合表达GCaMP3（绿色）和DsRedX（红色）。请注意，GCaMP3可以在树突和轴突以及细胞体中看到。比例尺，25μm。（D） SADΔG-GCaMP3-DsRedX感染V1神经元的定向选择性。D1-D4中的面板对应于面板C中标记为1-4的神经元细胞体（D1-D2）或树突（D3-D4）。方向调谐曲线绘制为整个刺激期间细胞体（D1和D2）或树突状片段（D3和D4）荧光的平均变化，响应于以随机顺序呈现在不同方向上的方波光栅。（E） 荧光随时间变化，以响应优先方向上的漂移光栅。时间0表示视觉刺激的开始，持续4秒，如黑色条所示。请注意，荧光是在与漂移光栅的时间频率相对应的时间频率上调制的。这些与视觉刺激同步的时间调制也可以在补充电影中看到。D和E中的值表示视觉刺激重复5次时ΔF/F值的平均值±S.E.M。
图3
图3。表达ΔG狂犬病病毒的ChR2-mCherry感染神经元的光激活
（A） 蓝光脉冲在ChR2-mCherry表达神经元中产生动作电位。在出生后9天的小鼠注射SADΔG-ChR2-m樱桃后6、8和10天，从S1桶皮层的第5层神经元进行细胞内记录。在电流闪烁期间，第8天和第10天（而不是第6天）的5 Hz和2 ms持续时间的蓝光脉冲可靠地产生了动作电位。（B） 记录的神经元充满生物细胞素并用链霉亲和素Cy2染色（绿色），mCherry呈阳性（红色）。比例尺，30μm。
图4
图4。用表达AlstR的ΔG狂犬病病毒诱导Allatostatin沉默神经活性
（A-C）注射SADΔG-GFP-AlstR后7天，从18天龄小鼠大脑皮层的脑薄片中的锥体神经元进行全细胞电流钳记录。（A） 在应用allotostatin（AL）之前，对去极化电流脉冲（+50、+100、+150和+200 pA，750 ms持续时间）的典型反应轨迹表明，只要+50pA就可以产生多个动作电位。（B） 1μM的配体AL使SADΔG-GFP-AlstR感染的神经元失活+在AL存在的情况下，200pA的电流不能再产生动作电位。（C）正常ACSF冲洗AL可部分逆转AL的作用+AL洗脱后150 pA诱导的动作电位。（D）记录的神经元以及相邻感染神经元的照片。记录的神经元充满生物细胞素并用链霉亲和素Cy3染色（红色），SADΔG-GFP-AlstR衍生的GFP阳性（绿色）。比例尺，30μm。
图5
图5。多西环素依赖性基因表达与SADΔG-GFP-rtTA狂犬病病毒条件性跨突触传播
（A，B）在用pTetO-CMVmin-Histone2B-mCherry-F2A-B19G和pCMMP-TVA对大鼠皮层切片培养的分离神经元进行生物转染后，应用EnvA-假型SADΔG-GFP-rtTA导致转染神经元的选择性感染。（A） 狂犬病病毒表达的dox和rtTA的存在允许mCherry在EnvA-SADΔG-GFP-rtTA感染的神经元中表达，如“突触后神经元”胞体的黄色（GFP和mCherri）外观所示。狂犬病糖蛋白在同一突触后神经元中的表达允许ΔG狂犬病互补，因此病毒可以传播到许多突触前神经元并在其中表达GFP。（B） 在没有dox（1.0μg/ml）的相同条件下，EnvA-SADΔg-GFP-rtTA狂犬病病毒也选择性感染分散的、孤立的TVA表达神经元。但如果没有dox，则没有mCherry或狂犬病糖蛋白表达，因此狂犬病病毒没有互补或跨突触传播。在没有dox的情况下，在脑切片中只能发现三个转染和最初感染的神经元（箭头所示的绿色细胞）。比例尺，100μm（右图），50μm（左图）。
图6
图6。ER表达的重组依赖性基因T2段CreER公司T2段或FLPoΔG狂犬病病毒
（A） 使用可诱导Cre重组酶对基因表达进行时间调控。悲伤ΔG-GFP-ERT2段CreER公司T2段激活转染pCALNL-DsRed（重组指示剂）的HEK293t细胞中DsRed的他莫昔芬依赖性表达。顶部和底部面板分别显示了三苯氧胺（+4HOT，1 nM）存在和不存在的结果。左侧面板显示狂犬病基因组中的GFP表达，中间面板显示4HOT存在时Cre诱导的DsRed表达（顶部），但不存在4HOT（底部）；以及右侧面板中的覆面。比例尺，100μm。（B） 病毒感染3天后，SADΔG-FLPo-DsRedX感染细胞在HEK293t细胞中表达红色荧光DsRedX。比例尺，100μm。（C，D）SADΔG-FLPo-DsRedX感染细胞中诱导的重组。X-gal染色显示，稳定表达frt-STOP-frt LacZ盒（重组指示剂）的HeLa细胞在SADΔG-FLPo-DsRedX（C）存在时表达LacZ，但在SAD△G-FLPo-DsRedX不存在时不表达。比例尺，300μm。
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