miR-34a regulates mouse neural stem cell differentiation

doi:10.1371/journal.pone.0021396

.2011;6（8）：e21396。

doi:10.1371/journal.pone.0021396。 Epub 2011年8月3日。

miR-34a调节小鼠神经干细胞分化

Márcia M Aranha公司¹, 丹妮拉·桑托斯, 苏珊娜·索拉, 克利福德·J·斯蒂尔, 塞西利亚·M·P·罗德里格斯

附属公司

PMID： 21857907
预防性维修识别码：项目经理153928
内政部： 10.1371/journal.pone.0021396

miR-34a调节小鼠神经干细胞分化

马尔西亚·阿兰哈等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（8）：e21396。

doi:10.1371/journal.pone.0021396。 Epub 2011年8月3日。

作者

Márcia M Aranha公司¹, 丹妮拉·桑托斯, 苏珊娜·索拉, 克利福德·J·斯蒂尔, 塞西利亚·M·P·罗德里格斯

附属

¹葡萄牙里斯本里斯本大学药学院药物和药物科学研究所。

PMID： 21857907
预防性维修识别码：项目经理153928
内政部： 10.1371/journal.pone.0021396

摘要

背景：微RNA（miRNAs或miRs）参与多种生物过程的调节，包括细胞分化。最近，miR-34a与单核细胞衍生的树突状细胞、人红白血病细胞和小鼠胚胎干细胞的分化有关。此外，miR-34家族成员已被确定为p53的直接靶点。然而，miR-34a在控制特定神经细胞类型分化程序中的功能仍基本未知。在这里，我们研究了miR-34a在调节小鼠神经干（NS）细胞分化中的作用。

方法/主要发现：miR-34a过表达增加了小鼠NS细胞的有丝分裂后神经元和轴突伸长，而抗miR-34a则有相反的作用。SIRT1被确定为miR-34a的靶点，可能介导miR-34a对轴突伸长的影响。此外，miR-34a过度表达后，p53（Lys 379）乙酰化和p53-DNA结合活性增加，细胞死亡不变，从而加强了p53在神经分化中的作用。有趣的是，在用白藜芦醇进行药物治疗激活SIRT1的情况下，miR-34a通过SIRT1独立机制促进星形细胞分化。

结论：我们的结果为miR-34a调节神经分化的分子机制提供了新的见解，这表明miR-34b在一定程度上是通过靶向SIRT1和调节p53活性来实现适当的神经分化所必需的。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。miR-34a调节NeuN-阳性细胞和神经突起生长的比例。**
在3天时，使用100 nM的抗miR-34a或pre-miR-34a转染小鼠NS细胞，并分别在24小时和72小时后收集。随后通过流式细胞术标记细胞进行Nestin、β-III Tubulin、NeuN和GFAP检测。**答：。**抗miR-对照（红线）和抗miR-34a转染培养物（蓝线）中Nestin、β-III Tubulin、NeuN和GFAP检测的代表性直方图(顶部)或在前miR-对照（红线）和前miR-34a-转染培养物（蓝线）中(底部). 在四个独立的实验中，观察到每个标记的阳性细胞相对数量发生了类似的变化。B。miR-34a调节后用流式细胞术评估NeuN阳性细胞的定量数据。**C、。**免疫荧光检测转染前miR-Control和前miR-34a的6天细胞中NeuN表达72小时。标尺，50µm。D。miR-34a调制后用免疫细胞化学方法评估NeuN阳性细胞的定量数据。**E.公司。**β-III Tubulin的代表性图像⁺预miR转染后48小时的细胞。荧光图像以黑白显示，并倒置以保持清晰。**F、。**给出了神经元数目和总神经元输出量，以量化miR-34a过度表达对细胞形态的影响。使用ImageJ v 1.43和NeuronJ插件v 1.4.2手动追踪神经细胞。结果显示为平均值±SEM*第页<0.05来自转染了相应对照的细胞。

**图2。miR-34a过度表达后SIRT1表达水平降低。**
使用特异性Taqman引物和GAPDH标准化，通过定量Real-Time-PCR分析miR-34a的表达。使用未分化细胞作为校准物，通过ΔΔCt法计算表达水平。通过免疫印迹法检测小鼠NS细胞在不同分化时间的SIRT1表达，或通过免疫细胞化学方法检测分化后2天的SIRTl表达。在分化3天时，用对照或前miR-34a转染的细胞也通过免疫印迹法进行SIRT1检测。**答：。**miR-34a在整个分化期的表达*第页<0.05,^† 第页<0.01和^§ 第页与第0天（未分化细胞）相比<0.001。数据表示四个独立实验的平均值±SEM。B。代表性免疫印迹显示自分化第3天起SIRT1表达水平显著降低。Ponceau S用作装载控制。**C、。**免疫荧光检测标记有抗SIRT1、抗Nestin和抗β-III微管蛋白抗体的细胞，以分别显示神经前体和神经元前体中的核SIRT1表达。Hoechst 33258染色用于观察细胞核。比例尺，10µm。D。代表性免疫印迹(顶部)以及相应的密度计分析(底部)在miR-34a转染前的细胞中显示SIRT1表达降低。数据表示三个独立实验的平均值±SEM*第页转染对照组的细胞<0.05。

**图3。miR-34a可能通过下调SIRT1的表达介导神经突起的生长。**
诱导分化后12小时，SIRT1在小鼠NS细胞中的表达受到调节。通过用干扰对照或100 nM的SIRT1 siRNA转染细胞来实现SIRT1的抑制，而用DMSO（对照）或5µM白藜芦醇处理细胞来激活SIRT1。第3天收集细胞，固定并处理以进行NeuN标记和流式细胞术检测，或进行β-III Tubulin的免疫细胞化学以及随后的神经突起伸长和分支表征。蓝线对应SIRT1调制，而红线对应相应的控制。**答：。**代表性免疫印迹显示SIRT1 siRNA转染后SIRT1表达降低。Ponceau S用作负荷对照。B。SIRT1调制对NeuN的百分比没有影响⁺细胞。**C、。**SIRT1下调后β-III管蛋白免疫细胞化学的代表性荧光显微镜图像。荧光图像以黑白显示，并倒置以保持清晰。D。测定神经突起数、总神经突起输出量和最长神经突起长度，以量化SIRT1下调对细胞形态的影响。使用ImageJ v 1.43和NeuronJ插件v 1.4.2手动追踪神经细胞。结果显示为平均值±SEM。^§ 第页<0.0001来自转染了相应对照的细胞。

**图4。miR-34a过度表达增加了p53和p53-DNA结合活性的乙酰化。**
将分化3天的小鼠NS细胞转染SIRT1 siRNA或干扰对照48小时，或转染前miR-对照或前miR-34a 72小时。然后收集细胞进行总蛋白和核蛋白提取，或用Annexin-V-APC/PI染色以评估细胞死亡。p53过表达细胞用于超转移和竞争实验。对应于p53的放射性标记双链寡核苷酸共识（p53-cons）作为探针。**答：。**代表性免疫印迹显示miR-34a的SIRT1沉默或过表达后赖氨酸379处p53乙酰化增加。Ponceau S用作装载控制。B。具有代表性的EMSA显示了用p53探针形成的复合物的特异性。使用抗p53抗体（DO-1，Santa Cruz Biotechnology）进行超位移实验。竞争实验是通过添加10倍或100倍的未标记双链寡核苷酸来进行的，这些寡核苷酸在共有位点（p53-cons-mut）发生突变，或者包含已知的两个或四分之一的p53共有位点或非特异性序列（NS）。**C、。**EMSA显示miR-34a转染前细胞48和72小时p53-DNA结合活性增加。D。典型的Annexin V-APC/PI染色显示miR-34a调制后没有细胞死亡。

**图5。miR-34a在白藜芦醇治疗下促进星形细胞分化。**
诱导分化12小时后，SIRT1在小鼠NS细胞中的表达受到调节。通过与烟酰胺孵育或用干扰对照或100 nM SIRT1 siRNA转染细胞来实现SIRT1的抑制。用DMSO（对照）或5µM白藜芦醇处理细胞可激活SIRT1。第3天收集细胞，固定并处理以进行GFAP标记，并通过流式细胞术和免疫荧光检测。蓝线对应SIRT1调制，而红线代表相应的控制。**答：。**用烟酰胺孵育，降低GFAP的百分比⁺细胞呈剂量依赖性。B。GFAP百分比下降⁺SIRT1沉默后的细胞(左边)以及增加的GFAP百分比⁺SIRT1激活后(*正确的*).C、。在白藜芦醇治疗下，miR-34a的过度表达导致GFAP的比例增加⁺单元格(*正确的*)而miR-34a下调具有相反的效果(左边).D。免疫荧光显示GFAP数量增加⁺白藜芦醇处理的细胞和miR-34a过度表达(底部)与控件相比(顶部). 比例尺，80µm。详细显示了放大400倍拍摄的图像*第页<0.05和^§ 第页<0.001来自转染了相应对照的细胞。NAM，烟酰胺。

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1. Krol J，Loedige I，Filipowicz W。微RNA生物发生、功能和衰变的广泛调控。Nat Rev基因。2010;11:597–610.-公共医学
1. Murchison EP、Partridge JF、Tam OH、Cheloufi S、Hannon GJ。Dicer-deficient小鼠胚胎干细胞的特性。美国国家科学院院刊2005；102:12135–12140.-项目管理咨询公司-公共医学
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