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.2011年8月；7（8）：e1002229。
doi:10.1371/journal.pgen.1002229。 Epub 2011年8月11日。

谷氨酰胺合成酶是乳腺上皮细胞类型特异性谷氨酰胺非依赖性的遗传决定因素

小倪公 1, 杰弗里·马克斯, Jen-Tan Chi先生
附属公司

谷氨酰胺合成酶是乳腺上皮细胞类型特异性谷氨酰胺独立性的遗传决定因素

小倪公等。 公共科学图书馆-基因. 2011年8月.

摘要

尽管不同细胞之间的代谢谱存在显著差异，但对于这种细胞类型特异性代谢表型和营养需求的遗传调控却知之甚少。虽然许多癌症细胞依赖外源性谷氨酰胺生存，以证明谷氨酰胺代谢的治疗靶向性，但谷氨酰胺依赖性的机制以及此类谷氨酰胺靶向策略在癌症中的可能反应和耐药性在很大程度上尚不清楚。在这项研究中，我们发现与乳腺分化相关的乳腺肿瘤亚型之间的谷氨酰胺依赖性存在系统性差异：基底型而非管腔型乳腺细胞对谷氨酰胺的依赖性更强，可能容易受到谷氨酰胺靶向治疗的影响。管腔型细胞的谷氨酰胺非依赖性与谷氨酰胺合成酶（GS）的谱系特异性表达有关。在不含谷氨酰胺的共同培养中，子宫内膜细胞也可以拯救基底细胞，这表明乳腺导管内可能存在谷氨酰胺共生现象。GS的腔特异性表达由GATA3直接诱导并抑制谷氨酰胺酶的表达。这种独特的谷氨酰胺依赖性和代谢共生性与乳腺分化过程中GS和谷氨酰胺独立性的获得相结合。了解控制不同代谢模式的遗传回路与不同细胞和生物体之间的许多共生关系有关。此外，GS预测谷氨酰胺代谢模式和肿瘤间依赖性的能力对于谷氨酰胺和其他代谢途径靶向治疗的合理设计和应用也至关重要。

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数字

图1
图1。不同乳腺癌细胞系的谷氨酰胺成瘾表型。
（A，B）在不同谷氨酰胺浓度下，七种显示乳腺癌细胞系（管腔型：蓝色，基底型：绿色）的标准化细胞生长（MTT试验）（A）和存活率（台盼蓝排除试验）（B）。（C） 这七个细胞系的正常细胞生长处于对照（+G+Q）、谷氨酰胺缺乏（+G-Q）、葡萄糖缺乏（-G+Q）和葡萄糖/谷氨酰胺缺乏状态（-G-Q）。（D） 当在谷氨酰胺缺乏的培养基中培养所示乳腺癌细胞系时，所示细胞系的标准化细胞ATP减少的百分比。（E，F）在常规培养基中生长的指示乳腺癌细胞系的谷氨酰胺消耗量（E）和细胞内谷氨酰胺浓度（F）。
图2
图2。编码谷氨酰胺代谢酶的基因在基底部和腔部乳腺癌细胞系中的差异表达。
（A） 显示问题表达水平的热图GLUL、GLS和GLS2级在已知为管腔型（蓝色）和基底型（绿色）乳腺癌细胞株的微阵列数据中。（B，C，D）GLUL公司（B） ，GLS公司（C） 和GLS2级（D） 用实时PCR测定的所指示的管腔和乳腺细胞系。（E） 蛋白质产品水平GLUL、GLS、，和GLS2级通过Western blots测定显示的管腔和基底乳腺细胞系。
图3
图3。编码谷氨酰胺代谢酶的基因在基底部和腔部乳腺肿瘤及原发上皮细胞中的持续差异表达。
（A） 显示了的平均表达水平，GLS公司和GLS公司2例发生在腔部和基底部乳腺肿瘤。（B） 显示问题表达水平的热图GLUL公司,GLS公司和GLS2级基底和管腔上皮细胞。（C，D，E）实时PCR测定的表达水平显示了GLUL公司（C） ，GLS公司（D） 以及GLS2（E）在原发性管腔和基底乳腺上皮细胞中的表达。（F） 蛋白质产品水平GLUL公司和GLS公司Western blots检测基底和管腔乳腺上皮细胞。
图4
图4。GLUL和GATA3的管腔表达对谷氨酰胺非依赖性表型的贡献。
（A） 在不含谷氨酰胺的情况下，使用或不使用GS抑制剂L-MS治疗的乳腺癌细胞系（管腔型：蓝色，基底型：绿色）的正常细胞存活率。（B） 用对照或两种靶向siRNAs处理MCF7（管腔细胞）时谷氨酰胺缺乏下细胞存活的程度GLUL公司（C）转染对照载体或GLUL公司过表达结构。（D） 的变化GLUL公司,GLS公司和GLS2级根据独立研究得出的阵列分析，在小鼠乳腺上皮细胞中转染GATA3。（E） 的级别GLUL公司用靶向GATA3的对照或siRNA处理MCF7细胞。（F） 的级别GLUL公司在用对照载体或GATA3表达构建体转染的MDAMB231细胞中。（G） 对照组或靶向GATA3的两个独立siRNA处理的MCF7细胞在谷氨酰胺剥夺下的相对存活率。（H） 在谷氨酰胺缺乏条件下，对照载体或GATA3过表达的MDAMB231细胞中显示的细胞存活率。（一） 的启动子区域GLUL公司显示了GATA3的两个潜在结合位点。（下划线的序列指示引物的位置。）（J）GLUL、ER（阳性对照）和白蛋白（阴性对照）不同启动子区的富集，这些启动子区用GATA3和对照IgG抗体进行免疫沉淀。（所有统计比较：*p<0.05，**p<0.01）
图5
图5。乳腺癌细胞系对谷氨酰胺缺乏的转录反应。
（A） 热图表示MCF7（管腔）和MDAMB231（基底）细胞对谷氨酰胺剥夺的转录反应。（B、C）。氨基酸反应（AAR）的预测概率显示为管腔（B，p） = 0.4，未配对t检验）和基础（C，p = 0.0016）癌细胞系在正常（4mM，Q4）和谷氨酰胺缺乏（0mM，Q0）培养基下生长。（D，E）在实时RT-PCR显示的谷氨酰胺浓度下，MCF7和MDAMB231中所选典型氨基酸响应基因的表达，包括XBP1（D）和DDIT3（E）。
图6
图6。管腔细胞和基底细胞之间谷氨酰胺共生的可能性。
（A） 不同谷氨酰胺浓度下MCF7中GS的蛋白质水平。（B，C）培养基（B）中谷氨酰胺水平和MCF7和MDAMB231细胞内谷氨酰胺浓度（C）的变化，剥夺谷氨酰胺12和24小时当用于繁殖与MDAMB231或MCF7共培养的MDAMB231细胞时。（G） 说明H，I（H，I）条件培养基模型的图表。用新鲜培养基、MDAMB231或MCF7条件培养基培养的MDAMB231-细胞的细胞活力（H）和培养基（I）中的谷氨酰胺。（J） 说明K（K）模型的图表。载体转染MDAMB231细胞中的细胞内谷氨酰胺。（五十） 说明M-O（M-O）共培养系统模型的图表。细胞活力（M）、培养基中的谷氨酰胺（N）以及与转染的MDAMB231细胞共培养的MDAMB31细胞中的细胞内谷氨酰胺浓度（O）。
图7
图7。GLUL对GLS的抑制有助于极化表达模式。
（A，B）GLS公司当用指定的siRNAs或过表达结构物治疗时，在指定的MCF7（管腔，空）和MDAMB231（基底，固体）中。（C，D）GLUL公司当用靶向GLS公司.（E）GLUL公司和GLS公司MDAMB231的蛋白质表达水平GLUL公司表达载体。（F，G）的表达式GLS公司用指定的siRNA或GATA3的表达构建体处理的MCF7（管腔、空的）和MDAMB231（基础、固体的）中的mRNA。（H） GLS公司具有指定表达结构的MDAMB231细胞中的蛋白质表达水平。
图8
图8。不同乳腺细胞谷氨酰胺代谢调节模型。
基于管腔和基底乳腺细胞数据的谷氨酰胺代谢酶的调节机制。
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参考文献

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