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比较研究
.2011年8月17日；31(33):11762-71.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2707-11.2011。

TrkB作为潜在的突触和行为标记

袁璐 1, 袁元吉, 桑达尔·甘尼桑, 罗伯特·施洛塞, 克里·马蒂诺维奇, 穆桑（Mu Sun）, 范梅, 摩西五世·赵, 白露
附属公司
比较研究

TrkB作为潜在的突触和行为标记

袁璐等。 神经科学. .

摘要

晚期长期增强（L-LTP）是一种长期记忆（LTM）的细胞模型，需要从头合成蛋白质。长期记忆的突触特异性的一个吸引人的假设是“突触标记”：突触活动产生一个标记，该标记“捕获”突触外的PRP（塑性相关蛋白）。在这里，我们提供证据表明，脑源性神经营养因子（BDNF）受体TrkB可能充当“突触标记”。TrkB通过微弱的θ-突发刺激（TBS）短暂激活，该刺激仅诱导早期LTP（E-LTP）。TrkB的激活独立于蛋白质合成，仅限于受刺激的突触。通过一条突触通路中的强刺激诱导L-LTP，将弱TBS诱导的E-LTP转换为第二条独立通路中的L-LTP。在弱TBS对第二途径的时间前后，TrkB的瞬时抑制降低了该途径中的L-LTP，而不影响第一途径。在行为上，训练前1小时将动物暴露在新的但不熟悉的环境中，可以将诱导短期记忆（STM）但不诱导LTM的弱训练巩固为LTM。STM培训期间抑制TrkB阻止了这种整合。这些结果表明TrkB是L-LTP和LTM突触特异性表达的潜在标记。

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数字

图1。
图1。
TBS对TrkB的瞬时和非蛋白合成激活。用12TBS或4TBS刺激Schaffer侧支，刺激CA1区，在TBS后的不同时间点快速解剖，并进行Western blotting。对于每个单独的时间点，pTrkB信号与TrkB总信号的比值根据同一实验的控制条件进行标准化。每个实验使用三只小鼠进行多个时间点的实验，每个时间点包含来自四个海马切片的CA1。同样的实验至少重复了六次(n个=6）英寸一个和B类，每一批都有新的动物。一个12TBS和4TBS诱导海马脑片TrkB激活的例子。TrkB的激活模式无明显差异。B类，量化4TBS在添加和不添加蛋白质合成抑制剂茴香霉素（40μ米). 包括由12TBS诱导的pTrkB时间进程以进行比较。C类，12TBS后1小时测定的TrkB活化的蛋白质合成独立性。示例（顶部）和定量（底部），n个=4）。茴香霉素（40μ米)不能阻止TBS诱导的pTrkB增加(*第页<0.05，单因素方差分析；“12TBS”组和“12TBS+茴香霉素”组之间无差异）。
图2。
图2。
BDNF对TrkB的局部激活。用BDNF-beads（绿色）处理海马神经元30分钟，并用磷酸化TrkB（pTrkB，红色）抗体染色。BDNF-基底接触树突后，局部pTrkB免疫反应性显著增强（箭头所示）。一个，优先激活与BDNF基底接触的树突上的TrkB。蓝色框突出显示的区域被放大并显示在右下角。注意与BDNF底座（绿色）相关的强pTrkB信号（红色），如箭头所示。B类，通过k252a阻断BDNF载体诱导的TrkB活化。用k252a和BDNF-beads（绿色）处理的神经元，即使树突被BDNF-boads接触，也显示出很少的pTrkB免疫反应性（箭头所示）。C类，单靠珠子触摸并不能激活TrkB。用不含BDNF的非偶联珠（绿色）处理神经元。即使珠子接触树突，树突沿线也检测到少量pTrkB免疫反应（箭头所示）。D类，培养海马神经元中基础TrkB激活水平低。在没有BDNF珠（星号）的树突中检测到少量pTrkB免疫反应。E类，沿着培养的海马神经元树突有丰富的TrkB免疫反应性（红色）。箭头显示了BDNF珠接触树突的位置。F类，不同条件下pTrkB免疫反应的定量。通过ImageJ对沿着树突的单个pTrkB免疫荧光斑点的强度进行量化。将BDNF微球接触点（0-5μm，5-10μm，20-50μm）的所有斑点的强度相加，并表示为任意单位（AU）。pTrkB信号从BDNF-基底接触点开始沿树枝晶逐渐减少。请注意，尽管BDNF-bead接触了其他分支，但BDNF-boad未接触的树枝状分支上几乎没有pTrkB信号。测量的感兴趣区域显示为“n个“针对每个条件***第页< 0.001; Newman–Keuls分析遵循单向方差分析。G–I型，经处理的培养海马神经元树突上总TrkB免疫反应性（红色）的共聚焦图像(H（H）)或不带(G公司)BDNF-结合珠和定量(我). 注意，BDNF-载体处理的总TrkB水平与不含BDNF-结合珠的对照相当。
图3。
图3。
12TBS诱导海马脑片CA1树突状区TrkB活化。一个海马切片pTrkBY816（绿色）和DAPI（蓝色）双重染色。海马CA1神经元的近端和远端分别用黄色和红色方框突出显示。刺激电极的位置由白色圆圈表示。B类,C类，对有或无12TBS的细胞体近端区域的pTrkBY816（绿色）和DAPI（蓝色）进行双重染色。注意，DAPI染色的CA1神经元细胞体位于图像的上部。D类,E类在有或无12TBS的情况下，对细胞体远端的pTrkBY816和DAPI进行双重染色。注意12TBS后pTrkB染色显著增加。F类,G公司，分别量化CA1神经元胞体近端和远端pTrkB阳性点的数量(*第页< 0.001,t吨测试）。
图4。
图4。
TrkB激活在L-LTP的前40分钟内起关键作用，但在STP中不起关键作用。一个，1NMPP1阻断了12TBS诱导的TrkB在TrkB中的激活F616A型老鼠。TrkB海马脑片CA1区F616A型12TBS后1h对小鼠进行显微解剖。每个实验使用三只小鼠，每个条件使用四片CA1切片。同样的实验重复了五次(n个=5），每个都有新的一批动物。1NMPP1（5μ米)而非载体控制（DMSO），阻止了12TBS诱导的TrkB中pTrkB的增加F616A型老鼠(*第页< 0.003; 单向方差分析）。B类，在来源于TrkB的成年海马切片中，通过用1NMPP1抑制TrkB激活来阻断12TBS诱导的L-LTPF616A型老鼠。1NMPP1（5μ米)在整个实验过程中应用于切片，完全阻断了L-LTP（蓝色菱形），而车辆控制没有任何效果（黑色圆圈）。1NMPP1对对照小鼠（C57BL/6）（粉红色钻石）的L-LTP没有影响。C类12TBS后立即应用1NMPP1也阻断了TrkB中的L-LTPF616A型片。D类，12TBS（红色）后0至40分钟内使用1NMPP1抑制L-LTP，而不是在TrkB 12TBS后45分钟F616A型切片（黑色）。E类，在不进行任何治疗的情况下，在>4小时内获得稳定的基线记录。F类、1NMPP1和车用TrkB中无法区分的STPF616A型片。2TBS诱导STP。在这两种情况下，fEPSP在2TBS后60分钟恢复到基线。
图5。
图5。
TrkB作为L-LTP的突触标记。一个，双通道记录方案。投射到同一CA1神经元的两条独立的Schafer侧支通路由位于记录电极两侧的两个刺激电极刺激。S1受强TBS（12TBS）刺激，而S2受弱TBS（4TB）刺激。B类，两条Schafer侧支通路之间缺乏促进作用。上图，无论S1是否提前30毫秒被刺激，S2诱导的叠加红色和绿色fEPSP轨迹是相同的。底部，无论S2刺激如何，S1诱导的fEPSP都是相同的。C类，弱TBS（4TBS）未能诱导L-LTP。单用4TBS仅能诱导E-LTP（持续<2小时），但不能诱导L-LTP。D类S2中的弱TBS诱导L-LTP，S1中的强TBS之前。在使用TrkB切片的典型“双通道”实验中F616A型小鼠，12TBS至S1，4TBS至S2。12TBS的应用在S1中产生了稳健的L-LTP。将4TBS应用于S2，通常只诱发E-LTP，现在诱发L-LTP。在4TBS前后使用载体（用黑条表示）治疗对TrkB中的L-LTP没有影响F616A型片。E类，抑制TrkB激活阻止S2中E-LTP→L-LTP转换。“双通道”实验的完成方式与D类，除了1NMPP1（5μ米)应用了，而不是车辆（DMSO）。1NMPP1治疗可阻断S2的L-LTP，而不影响TrkB中S1的L-LTF616A型片。F类，1NMPP1对野生型海马脑片中的L-LTP缺乏影响。在4TBS（黑条）前后，将1NMPP1应用于C57BL/6小鼠海马脑片。12TBS在S1中诱导166±10%的增强，而4TBS在S2中诱导138±5%的增强。G公司，车辆对TrkB中的L-LTP缺乏影响F616A型片。当在12TBS时施用溶媒时，S1（158±9%）和S2（135±10%）均诱导L-LTP。H（H），1NMPP1抑制S1中的L-LTP（104±5%），但在12TBS时使S2中的L-LTP保持不变（135±5%）。括号中显示了测试的切片数。每个实验至少测试三只动物。
图6。
图6。
TrkB作为L-LTP突触标记的进一步证据。“双向”实验的方法与图5完全相同，只是在S1应用12TBS之前40分钟（而不是之后60分钟）将4TBS应用于S2。黑色条表示1NMPP1或车辆（DMSO）的应用。一个，用1NMPP1（5μ米)以TrkB为单位F616A型切片阻断S2中的L-LTP，而不影响S1中的L-LTP。B类，L-LTP由S1中的12TBS和TrkB中S2中的4TBS诱导F616A型4TBS前后用载体处理切片。C类在4TBS前后，用1NMPP1处理野生型（C57BL/6）切片，S1中的12TBS和S2中的4TBS诱导L-LTP。D类，Synaptic标记模型，用于双向录制。强刺激（12TBS）和弱刺激（4TBS）均可产生短寿命突触标记，而PRP只能由强刺激诱导产生。标记波和PRP波的重叠表明捕获了PRP，导致该特定途径中的L-LTP。
图7。
图7。
TrkB作为LTM的行为标记。在IA任务中训练小鼠，每1s进行两次微弱的足部电击（0.1 mA，100 ms）。记录从照明室到暗室穿过门的延迟时间，作为记忆测量。数据绘制为平均值±SEM，在单因素方差分析后进行Newman–Keuls分析。每一列中都标明了受试小鼠的数量。一个,C类用不同组的野生型小鼠或TrkB评估STM（60分钟）和LTM（24小时）F616A型小鼠。弱IA训练只诱发STM，而不诱发LTM。B类在新环境（四个物体的开放场，OF）中的探索将弱IA诱导的STM合并为LTM。1NMPP1没有阻止野生型小鼠的固结。D类、TrkB中新奇推广的LTMF616A型通过腹膜内注射1NMPP1来阻断小鼠。
图8。
图8。
1NMPP1抑制TrkB后，短期记忆、疼痛感、情绪状态和运动正常。一个，1NMPP1抑制TrkB后短期记忆正常。在腹腔注射1NMPP1或载体后10分钟，用两次微弱的足电击（0.1 mA，100 ms）以1s的间隔对小鼠进行IA任务训练。记录从照明室到暗室穿过门的延迟时间，作为记忆测量值，并绘制为平均值±SEM。B类，1NMPP1抑制TrkB后疼痛感觉正常。在55°C下进行热板试验。舔前爪和后爪的延迟绘制为平均值±SEM。C–E类1NMPP1抑制TrkB后，情绪状态和运动正常。使用环形平台进行高架零迷宫测试，该平台由两个由等长开口部分隔开的壁（白色树脂玻璃）部分组成。记录每只小鼠的活动5分钟。注射1NMPP1的小鼠在张开双臂中的时间与注射溶媒的小鼠相似(C类). 此外，1NMPP1不影响小鼠进入开放臂的次数(D类)以及老鼠在迷宫中行走的总距离(E类).
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