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.2011年8月16日7:523。
doi:10.1038/msb2011.56。

致癌K-Ras使葡萄糖和谷氨酰胺代谢解耦以支持癌细胞生长

丹妮拉·加利奥 1, Christian M Metallo公司, 保罗·加梅罗, 卡斯滕·希勒, 劳拉·萨拉·丹纳, 基亚拉·巴列斯特列里, 百合, 斯特凡诺普洛斯, 费迪南多·奇亚拉东纳
附属公司

致癌K-Ras使葡萄糖和谷氨酰胺代谢解耦以支持癌细胞生长

丹妮拉·加利奥等。 分子系统生物. .

摘要

癌基因如K-ras在肿瘤发生过程中介导细胞和代谢转化。为了分析K-Ras依赖的代谢改变，我们采用了¹³C代谢通量分析（MFA）、非靶向示踪剂归宿检测（NTFD）和⁵N-标记谷氨酰胺和小鼠成纤维细胞和人类癌细胞系的转录组分析。稳定同位素标记的葡萄糖和谷氨酰胺示踪剂以及细胞内流量的计算测定表明，表达致癌K-Ras的细胞表现出更强的糖酵解活性，通过三羧酸（TCA）循环降低氧化流量，并增加谷氨酰胺在合成代谢合成中的利用。令人惊讶的是，在两种转化细胞系中均检测到TCA循环相关代谢物的非规范标记。转录谱检测到在用致癌K-Ras转化后，与糖酵解、谷氨酰胺代谢和核苷酸生物合成相关的几个基因的表达升高。沿着这些途径的酶的化学扰动进一步支持糖酵解和TCA代谢的解耦，谷氨酰胺提供增加的碳来驱动TCA循环。这些结果为致癌K-Ras在癌细胞代谢重编程中的作用提供了证据。

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数字

图1
图1
K-Ras转化的成纤维细胞解耦糖酵解和TCA循环。(A类)生长54小时的N和T细胞对Glc、Lac、Gln和Glu的细胞外摄取和分泌。(B)用GC/MS测定N细胞和T细胞中的相对代谢物丰度(C类)用1:1混合物培养的N和T细胞中Cit和Glu的M2标记-13C] 葡萄糖和[U-13C类6]葡萄糖。(天)[U存在下培养细胞中天冬氨酸的质量同位素分布（MID）-13C类5]谷氨酰胺。误差条表示s.e.m(n个=3). (E类)使用[U标记M3-M4-Asp所涉及的代谢途径的示意图13C类5]谷氨酰胺示踪剂。在该方案中，代表了参与这些代谢途径的关键细胞质和线粒体酶。(F类)在N细胞系和T细胞系中，参与方案（E）中所述途径的一些基因的绝对表达值。收集生长在25 mM Glc+4 mM Gln（正常培养基）中的两个细胞系，在两个不同的时间点（48和72小时）进行转录分析。基因缩写列表见补充信息。
图2
图2
用NTFD分析鉴定与[α]培养的细胞中的标记代谢物-15N] 谷氨酰胺54小时(A类)N中氨基酸及其衍生物代谢物的M1标记(□)和T(▪) 细胞。(B)N中游离腺嘌呤中观察到M1和M2标记(□)和T(▪) 细胞。(C类)参与N（蓝线）和T（红线）细胞系Gln代谢的基因的热图，以及在正常培养基中生长并在两个不同时间点（1=48 h和2=72 h）收集的两个细胞系之间的相应比率（T/N）。(天)N（蓝线）和T（红线）细胞系嘌呤代谢相关基因的热图，以及在正常培养基中生长并在两个不同时间点（1=48 h和2=72 h）收集的两个细胞系之间的相应比率（T/N）。颜色刻度条表示标准化的表达式强度（对数刻度）；尤其是绿色低表达，红色高表达，黑色无变化表达。当比率为⩾1.1时，比率值表示为上色，当比率为\10877; 0.9时表示为下绿色，当比率在0.9和1.1之间时表示为无变化的黄色。基因缩写列表见补充信息。
图3
图3
MDA-MB-231人癌细胞株表现出糖酵解增强和TCA循环活性降低。(A类)MDA-MB-231细胞以3000个细胞/厘米的速度进行电镀2在正常介质中的6孔板中。18小时后用正常培养基替换培养基(◊), 或含有1 mM Glc+4 mM Gln的培养基(□)或25 mM Glc+0.5 mM Gln(▵). 然后，在指定的时间点收集细胞并进行计数。(B)54小时后Glc和Gln的细胞外摄取以及Lac和Glu的分泌(C类)Glc摄取与Gln摄取的比率。(天)在[U存在下培养的细胞中Fum、Mal和Asp的MID-13C类5]谷氨酰胺。(E类)PDH通量与Glc摄取的比率。误差条表示s.e.m(n个=3）使用误差传播。
图4
图4
正常和小鼠K-Ras转化细胞中代谢通量和转录数据的综合图示。(A类,B)利用通量分析和转录数据，比较T细胞和N细胞中确定的代谢途径的整合图。代谢通量和基因表达值的T细胞和N细胞之间的比率用颜色代码表示（如右上角的图例所示），如下所示：流量分析用黑色（无变化值）、红色（增加值）和绿色（减少值），以及上色T/N比率⩾1.1，转录数据的下绿色T/N比率为0.9，无变化年色T/N比率在0.9和1.1之间。图中使用的基因缩写列表可在“补充信息”中找到。利用[U-13C类5]谷氨酰胺，一种[U的混合物-13C类6]葡萄糖和1-13C] 葡萄糖（A）和[α-15N] 谷氨酰胺（B）作为特定同位素示踪剂。净通量和交换通量的计算方法如“材料和方法”所述。如“材料和方法”所述，获得了N和T调节基因的转录数据。
图5
图5
N、T和R细胞系中的相对代谢物浓度以及氨基氧乙酸（AOA）和表没食子儿茶素没食子酸（EGCG）处理对其增殖的影响。Cit评估(A类)，马尔(B)，谷氨酸(C类)，和Asp(天)在正常培养基中生长54h后，用酶法测定细胞内浓度。AOA分析(E类)和EGCG(F类)对N、T和R细胞系增殖的处理。细胞，以3000个细胞/厘米的密度播种218小时后，在完全更换培养基后，用100μM AOA或1 mM天冬氨酸二甲酯（DMD）或2 mMα-酮戊二酸二甲酯或20μM EGCG处理，并在指定的时间点计数。误差条表示s.e.m(n个=3).
图6
图6
(A类)EGCG抑制剂对N、T和R细胞系的短期影响。细胞，以3000个细胞/cm的密度接种218小时后，在完全更换培养基后，用20μM EGCG和/或5 mM NAC处理，并在指定的时间点进行计数。(B)通过荧光显微镜分析细胞死亡，使用PI（红色）、Annexin V（绿色）和Hoechst进行细胞核染色（蓝色）。细胞以3000个细胞/厘米的速度进行培养2在微玻璃上，如上所述进行处理，并在8小时后进行分析。使用Metamorph 7软件通过×60物镜获取图像。(C类)通过酶测定分析细胞内ATP水平。按照上述方法处理细胞，并在指定的时间点收集。(天)使用5 mM DCFH测量细胞内ROS水平2-DA染色。按照上述方法处理细胞，并在指定的时间点收集。误差条表示s.e.m(n个=3).
图7
图7
K-Ras癌细胞中Glc和Gln通路解耦的示意图。Glc为具有致癌K-Ras的癌细胞提供主要能源。相反，Gln提供碳和氮用于合成生物量构建块（氨基酸、核苷酸和脂肪酸）。红色箭头代表增强通量，绿色箭头代表减少通量，黑色箭头代表无变化通量，蓝色箭头代表TCA循环的正向通量，天蓝色代表还原羧化通量。
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引用人

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