Measurement of peroxiredoxin activity

doi:10.1002/0471140856.tx0710s49

.2011年8月：第7章：第7.10单元。

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过氧化物酶原活性的测定

金伯利·J·纳尔逊¹, 德里克·帕森纳奇

附属公司

PMID： 21818753
PMCID公司：项目经理3703631
内政部： 10.1002/0471140856.tx0710s49

过氧化物酶原活性的测定

金伯利·J·纳尔逊等。当前原毒物. 2011年8月.

.2011年8月：第7章：单元7.10。

doi:10.1002/0471140856.tx0710s49。

作者

金伯利·J·纳尔逊¹, 德里克·帕森纳奇

附属

¹美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆维克森林大学医学院生物化学系。

PMID： 21818753
PMCID公司：第703631页
内政部： 10.1002/0471140856.tx0710s49

摘要

过氧化物酶是半胱氨酸依赖性过氧化物酶，可与过氧化氢、较大的氢过氧化物底物和过氧亚硝酸盐反应。提供了通过以下方法测量过氧化物Prx活性的方案：（1）与NADPH、硫氧还蛋白还原酶和硫氧还毒素的偶联反应，（2）直接监测硫氧还氧化酶的氧化，（3）与辣根过氧化物酶的竞争，以及（4）使用FOX分析法的过氧化物消耗。

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数字

图1
在NADPH、Trx和TrxR存在下测定Prx活性。Prx（-SP-）中的过氧化半胱氨酸与过氧化物反应形成半胱氨酸磺酸（Prx-SPOH），然后在2-Cys-Prxs中与分解半胱氨酸（SRH）形成二硫键。Prx二硫化物被Trx还原，电子最终通过TrxR来自NADPH。如基本方案1所述，当NADPH被氧化时，Prx的周转被监测为340 nm处吸光度的变化。对于细菌AhpC-like蛋白质，AhpF可以替代Trx和TrxR。

**图2。动力学分析以确定*梅毒螺旋体*AhpC与*大肠杆菌*Trx和t吨-过氧化氢丁酯（tButHP）**
A类根据Michaelis-Menten方程的Hanes-Woolf表示绘制所有底物浓度的数据，以获得表观V_最大值每个Trx浓度。B类视在V_最大值绘制每个Trx浓度的值与Trx浓度，以获得真实k_猫和K_米^色氨酸值。真正的k_猫然后可以使用从图B中获得的值来计算K_米^t但HP使用图A中的y轴截距。C类图A和图B中显示的所有数据都可以使用计算机程序的多功能非线性回归功能进行全局拟合，例如Sigmaplot（Systat Software Inc.San Jose，CA）。

图3
通过直接监测Trx氧化测定Prx活性。如《基本方案2》所述，Prx与过氧化物反应，在过氧化物半胱氨酸（SPOH）上形成亚硫酸，最终形成二硫键。Trx的荧光随着其被氧化而降低，并减少Prx二硫化物。

**图4。硫氧还蛋白在氧化过程中荧光降低**
Prx和过量过氧化物存在时的总荧光变化（ΔF）用于转换荧光变化率（V s）⁻¹转化为μM过氧化物s⁻¹微米⁻¹Prx使用公式：速率（μM过氧化物s⁻¹微米⁻¹Prx）=速率（V s⁻¹)·[Trx]/（ΔF x[Prx]），其中[Trx]和[Prx]分别是硫氧还蛋白和Prx的最终浓度。

图5
通过与辣根过氧化物酶（HRP）竞争测定Prx活性。如基本方案3所述，HRP被H2O2氧化形成化合物I，可在403 nm处监测吸光度的降低。由于还原的Prx（Prx-SP–）与H2O2反应生成硫酸（Prx-SPOH），用于氧化HPR的过氧化物较少，导致化合物I的生成减少。

**图6。Prx抑制HRP与过氧化氢的反应，并可用于测量k_Prx公司**
A类当化合物I在过氧化氢存在下形成时，403 nm处的HRP吸光度降低。B类随着Prx浓度的增加，由于对可用过氧化物的竞争，形成的化合物I的数量减少。过氧化氢与HRP反应的相对量（ΔA_{光突发事件})和Prx（ΔA_最大值-ΔA_{光突发事件})可用于计算k_应用程序使用方程式3计算每个Prx浓度。C类（ΔA）的值_最大值-ΔA_{光突发事件})/ΔA_{光突发事件})·k_{人力资源计划}绘制[HRP]与[Prx]并通过线性回归进行拟合。线的斜率提供k_Prx公司用于过氧化氢。所示为7.5μM HRP、4μM过氧化氢和增加预还原浓度的代表性数据*鼠伤寒沙门菌*25 mM磷酸钾、1 mM EDTA、pH 7.0中的AhpC

图7
Prx抑制HRP与过氧化氢的反应，并且可以用于测量kPrx。（A）当化合物I在过氧化氢存在下形成时，403 nm处的HRP吸光度降低。（B）随着Prx浓度的增加，由于对可用过氧化物的竞争，形成的化合物I的量减少。过氧化氢与HRP（1Abs）和Prx（1Amax–1Abs。（C）将（（1Amax–1Abs）/1Abs）·kHRP[HRP]的值与[Prx]进行绘图，并通过线性回归进行拟合。该线的斜率为过氧化氢提供kPrx。所示为7.5μM HRP、4μM过氧化氢和预先还原的鼠伤寒沙门菌AhpC在25mM磷酸钾、1mMEDTA、pH 7.0中浓度增加的代表性数据。

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