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.2012年3月；6(1):11-25.
doi:10.1007/s12079-011-0141-3。 Epub 2011年7月5日。

CCN3/NOV小干扰RNA增强原代肝星状细胞和肝硬化储脂细胞系CFSC中纤维化基因的表达

埃拉旺·博尔坎-坎普斯特 1, 克劳迪娅·范·罗恩, 埃迪·范德勒尔, 尤尔根·弗洛格（Jürgen Floege）, 拉尔夫·魏基尔琴
附属公司

CCN3/NOV小干扰RNA增强原代肝星状细胞和肝硬化储脂细胞系CFSC中纤维化基因的表达

埃拉旺·博尔坎-坎普斯特等。 J电池通信信号. 2012年3月.

摘要

肾母细胞瘤过度表达基因编码CCN家族的基质细胞蛋白（CCN3/NOV），包括CCN1（CYR61）、CCN2（CTGF）、CCN4（WISP-1）、CCN 5（WISP-2）和CCN6（WISP-3）。CCN蛋白参与多种细胞类型中有丝分裂、粘附、凋亡、细胞外基质生成、生长停滞和迁移的调节。与CCN2/CTGF（已知的促纤维化蛋白）相比，CCN3/NOV在肝纤维化中的生物学作用尚不清楚。在本研究中，我们发现ccn3/nov mRNA在肝星状细胞激活后显著增加，在完全转分化的肌成纤维细胞中达到峰值水平。在实验性肝纤维化模型中，CCN3/NOV在mRNA和蛋白质水平上显著增加。CCN3/NOV主要存在于组织损伤和修复区的非实质细胞中。在胆管结扎模型中，CCN3/NOV主要定位于门管区，而反复应用四氯化碳导致CCN3/NOV主要在小叶中心区表达。与CCN2/CTGF相比，促纤维化细胞因子血小板衍生生长因子-B和-D以及转化生长因子-β抑制CCN3/NOV的表达。在体外，CCN3/NOV siRNA能够很好地抑制肝硬化脂肪储存细胞系CFSC中的迁移，这与体内的研究结果一致，即表达CCN3/NOV的各种类型的细胞迁移到组织损伤和再生区域。CCN3/NOV的抑制增强了原代大鼠肝星状细胞和CFSC中纤维化前标志蛋白的表达，如α-平滑肌肌动蛋白、I型胶原、纤维连接蛋白、CCN2/CTGF和TIMP-1。我们进一步发现，腺病毒过度表达CCN2/CTGF抑制了CCN3/NOV的表达，而CCN3/NOV的过度表达以及靶向siRNAs对CCN3/NOV的抑制均导致CCN2/CTFF表达增强。这些结果表明CCN作用的复杂性远远超出了经典的阴阳相互作用。

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图1
图1
CCN3/NOV在培养的HSC和体内实验性肝纤维化中的表达。一来自培养激活的HSC的定量RT-PCR（TaqMan）显示CCN3/NOV显著上调，在完全转分化的MFB中达到峰值水平。b条HSC蛋白裂解物的Western blot分析显示，培养激活的HSC和MFB中CCN3/NOV蛋白表达增加，与纤维连接蛋白、I型胶原、α-SMA和CCN2/CTGF表达增加相关。在该分析中，β-肌动蛋白被用作负荷控制。c（c）CCN3/NOV在BDL和慢性CCl中的相对mRNA表达4-处理过的大鼠肝脏。定量RT-PCR（TaqMan）显示CCN3/NOV的相对mRNA水平在BDL和CCl后显著增加4管理。在整个肝纤维化期间，表达水平与CCN2/CTGF和α-SMA的表达水平相当。d日BDL和CCl的CCN3/NOV免疫组织化学4大鼠肝脏的间充质细胞和沿BDL大鼠肝脏纤维化间隔增生的胆管上皮呈阳性染色。CCl公司4模型显示肝小叶中心坏死性脂肪变性周围窦周区呈阳性染色
图2
图2
PDGF和TGF-β下调HSC中CCN3/NOV的表达。一qRT-PCR、，b条Western blot和c（c）条件培养液ELISA显示PDGF-B和-D以及TGF-β显著降低培养激活HSC中CCN3/NOV的mRNA和蛋白表达。d日PDGF的抑制作用被作为PDGF-B和PDGF-D的特异性拮抗剂的可溶性PDGF-β受体（可溶性PDGFRβ，sR）所中和
图3
图3
CCN3/NOV siRNA诱导培养激活的HSC中的纤维化前基因表达。原代培养一天的HSC转染对照siRNA和四种不同的CCN3/NOV siRNA 48 h。CCN3/NOV的成功下调在一qRT-PCR分析和b条ELISA使用来自相同实验的培养上清液。在48小时内，所有CCN3/NOV siRNA都增加了α-SMA、I型胶原和CCN2/CTGF mRNA的表达。c（c）相位对比显微镜显示72小时siRNA转染后HSC细胞的形态，并显示CCN2/NOV siRNA转导的细胞含有较少的脂肪滴和向MFB表型的更高级转分化。d日转染72 h siRNA的Western blot证实CCN3/NOV基因敲除可增加α-SMA、纤维连接蛋白、波形蛋白和CCN2/CTGF的表达。在分析时，HSC在原代培养中首次电镀后总共保存了10天
图4
图4
通过siRNA技术抑制CCN3/NOV和CFSC中的成纤维基因表达。一用非特异性siRNA对照、靶向CCN3/NOV表达的siRNA（siNOV3、siNOV4、siNOV5、siNOV6）或大鼠NOV的表达载体（大鼠NOV-1）转染CFSC，并在0.5%FCS中维持48小时。从各自的细胞中分离出RNA，并进行qRT-PCR，结果表明CCN3/NOV siRNA增加了α-SMA、I型胶原和CCN2/CTGF mRNA的表达，而CCN3/NOV的过度表达没有显著影响。b条定量RT-PCR显示siRNA靶向转染ccn3/11月基因表达导致ccn3/11月mRNAs，而用表达载体大鼠NOV-1转染后表达显著增加.c（c）在使用同一实验的细胞上清液进行ELISA测试时，进一步证明了CCN3/NOV的击倒功效。d日将CCN3/NOV siRNAs和大鼠NOV-1表达载体转染CFSC 96 h。制备细胞提取物并通过Western blot分析纤维结合蛋白、I型胶原、α-SMA、CCN2/CTGF、TIMP-1和β-Actin的表达
图5
图5
CCN3/NOV腺病毒基因在原代造血干细胞中的转移。一用2×10转导原代HSC8Ad5-CMV-rNOV、Ad5-CMV CTGF和Ad5-CMV-Luc的病毒数/ml作为对照，在10%的FCS中维持48小时，或在饥饿16小时后再刺激TGF-β24小时。制备细胞裂解物并用Western blot进行分析。分析表明，HSC维持在10%的FCS中，过度表达CCN2/CTGF和CCN3/NOV显示MMP9表达增加，而TIMP-1和I型胶原表达降低。b条,c（c）CCN2/CTGF在HSC中的过度表达导致CCN3/NOV下调，但CCN3/NOV的过度表达诱导CCN2/CTFF的生成增强。d日当细胞感染驱动CCN3/NOV表达的腺病毒时，维持在0.5%FCS中的HSC显示CCN2/CTGF上调。请注意，TGF-β刺激HSC诱导CCN2/CTFF表达e（电子）CCN3/NOV过度表达略微降低TGF-β诱导的I型胶原和α-SMA表达，而CCN2和CCN3显著降低TIMP-1
图6
图6
CCN3/NOV对细胞迁移和增殖的影响。一,b条根据材料和方法一节中概述的方案，在CCN3/NOV siRNA转染的CFSC中进行划痕诱导迁移试验。所有转染CCN3/NOV siRNA的CFSC在20和40小时后显示明显延迟伤口间隙闭合，在光镜分析中可见(一)并通过gab闭合定量证实(b条).c（c）将对照siRNA和靶向CCN3/NOV的siRNA转染CFSC。饥饿24小时后，在BrdU存在下用PDGF-B刺激细胞。使用ELISA BrdU比色分析试剂盒测量BrdU的掺入量。所有CCN3/NOV siRNA均抑制PDGF诱导的细胞增殖(左侧面板)，但细胞计数无差异(右侧面板).d日如图所示，CFSC感染了腺病毒。Ad5-CMV-rNOV转导诱导CCN3/NOV的高效表达，并有效分泌到培养基中(左侧面板)但与对照培养物相比，对照Ad5-CMV-荧光素酶和Ad5-CMV CTGF转导的CFSC对细胞计数没有影响(右侧面板).e（电子）将CFSC饥饿并用指定剂量的外源CCN3/NOV孵育过夜，然后用20 ng/ml PDGF-B和BrdU孵育24小时。CCN3/NOV处理的细胞在浓度为200和500 ng/ml的0.5%FCS中显示BrdU掺入显著减少(左侧面板)分别是。然而，该分析显示细胞数量没有差异(右侧面板).（f）原代HSC如所示用腺病毒感染，培养基在24小时后在BrdU存在下改变为0.5%或10%FCS 48小时或24小时。Ad5-CMV-CTGF和Ad5-CMV NOV均显著降低了维持在0.5%FCS中的HSC组的BrdU掺入量，但在10%FCS中无显著差异(左侧面板). 细胞计数显示，当细胞在含有10%FCS的培养基中培养时，Ad5-CMV-CTGF和Ad5-CMV NOV（而非腺病毒控制载体Ad-CMV-Luc）均能抑制细胞生长(右侧面板)
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