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。2011年7月26日；108(30):12425-30.
doi:10.1073/pnas.1106645108。 Epub 2011年7月11日。

肿瘤相关巨噬细胞调节肿瘤干/起始细胞的致瘤性和抗癌药物反应

Masahisa Jinushi先生 1, 千叶志贵, 吉山弘一, Kenkichi Masutomi先生, 基诺西塔一郎, Hirotoshi Dosaka-Akita公司, Yagita秀夫, Akinori Takaoka公司, Hideaki Tahara公司
附属公司

肿瘤相关巨噬细胞调节肿瘤干/起始细胞的致瘤性和抗癌药物反应

Masahisa Jinushi先生等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

最近的证据揭示了具有干细胞活性的肿瘤细胞在致瘤性和耐药性中的关键作用，但肿瘤微环境如何调节肿瘤干细胞/起始细胞（CSC）尚不清楚。我们阐明了肿瘤相关巨噬细胞（TAM）及其下游因子乳脂球-表皮生长因子-VIII（MFG-E8）在CSC活性调节中的作用。骨髓嵌合系统和过继细胞移植阐明了来自TAM的MFG-E8在赋予CSC促进致瘤性和抗癌药物耐药性的能力方面的重要性。MFG-E8主要激活CSC中的信号转导子和转录激活子-3（Stat3）和Sonic Hedgehog通路，并与IL-6协同进一步增强其抗癌药物耐药性。因此，肿瘤相关炎症关键因子的药理靶向性为通过操纵CSC活性根除耐药肿瘤提供了独特的策略。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
CSCs诱导TAM表达MFG-E8。(A类)80层/四层+CD11b细胞+从携带CD44的小鼠的肿瘤、肿瘤引流淋巴结（TDL）和脾细胞中分离出巨噬细胞+阿尔德福勒+MC38-CSC或CD133+阿尔德福勒+3LL-CSC或其非CSC对应方(n个=每组3人）。通过RT-PCR对小鼠MFG-E8 mRNA进行定量。结果显示为目标基因相对于参考基因（GAPDH）的折叠诱导。(B类)F4/80中MFG-E8的表达+CD11b型+从MC38-CSC或非CSC分离的巨噬细胞通过细胞内流式细胞术进行评估。CSC荷瘤小鼠（脾脏）的脾巨噬细胞作为阴性对照。(C类)MC38 CSCs或非CSCs，用F4/80培养大量MC38细胞+脾巨噬细胞（Mac）24小时，巨噬细胞中MFG-E8（F4/80+)或MC38肿瘤细胞（F4/80−)流式细胞术定量。未经共培养的脾巨噬细胞或MC38肿瘤细胞作为阴性对照。表达为平均荧光强度（MFI）。(D类)CD68中的MFG-E8+从两名非小细胞肺癌患者（Pt-1和Pt-2）的胸腔积液（PE）或外周血（PBMC）中分离出的巨噬细胞（Mac）。MFG-E8 mRNA(左侧)或蛋白质(赖特)分别用RT-PCR或流式细胞仪分析其水平。数据是三个独立实验的代表。
图2。
图2。
TAM有助于以MFG-E8依赖性的方式触发致瘤性和抗癌药物耐药性。(A类)将MC38-CSCs或3LL-CSCs接种到野生型（WT）或MFG-E8缺陷型（MFG-E8KO）小鼠中1个月，并通过量化每个CSC标记物来确定已建立肿瘤中CSCs的频率。代表性点图(上部)和三个实验的数据(下部)如图所示。(B类)从野生型（WT）或MFG-E8缺陷CD45.1的肿瘤中分离出TAM+小鼠（MFG-E8 KO）。将MC38-CSC或非CSC注射到CD45.2中+MFG-E8–缺陷小鼠（CSC或非CSC→MFG-E8KO；n个=4/组）单独或与TAM联合治疗，在肿瘤接种后用CDDP治疗，并在指定的日期测量肿瘤生长。(C类)CD44细胞+ALDH1型+在存在或不存在野生型（WT）或MFG-E8缺陷型（MFG-E8 KO）小鼠的TAM上清液（1:10稀释），或感染对照或MFG-E8逆转录病毒的脾巨噬细胞的情况下，用CDDP处理MC38 CSC。处理24小时后，通过比色法通过裂解半胱天冬酶-3的强度来量化细胞活力。数据是三个独立实验的代表。
图3。
图3。
MFG-E8在肿瘤自我更新中起着关键作用。(A类)用来自野生型（WT）或MFG-E8缺陷型（MFG-E8 KO）小鼠的TAM上清液（1:10稀释）或重组鼠MFG-E8蛋白（1或10μg/mL）在超低附着板中处理MC38细胞。然后将细胞培养三代，并测定每10000个细胞生成的球形物的数量。(B类)进行体内连续肿瘤传代以评估CSC的发生频率。将来自野生型或MFG-E8缺陷小鼠的TAM与MC38-CSCs s.c.一起注射到MFG-E8-缺陷小鼠体内(n个=每组4个），1×105每个鼠标。30天后，从生长中的肿瘤中制备单细胞悬浮液，并使用指定数量的细胞将每种TAM进一步移植到无肿瘤的MFG-E8缺陷小鼠中。在指定日期测量肿瘤生长。(C类)EpCAM公司+CD133型+晚期非小细胞肺癌患者肿瘤细胞（1×102每只小鼠）接种到氯膦酸钠致NOD-SCID小鼠(n个=4个/组），有或没有自体TAM或外周血巨噬细胞（PBM），存在同型对照Ig或抗人MFG-E8抗体。每个肿瘤的生长曲线(左侧)和代表性结果(赖特)如图所示。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图4。
图4。
MFG-E8诱发的致癌信号。(A类)CD44裂解物上pSTAT3、STAT3和SMO的免疫印迹+ALDH1型+MC38（CSC）或其非CSC对应物在用野生型TAM上清液（TAM）刺激或不刺激2小时后（−）。(B类)用野生型（WT）或MFG-E8缺陷型（MFG-E8KO）小鼠的TAM上清液或脾巨噬细胞（SPM）处理MC38-CSCs 6 h。通过流式细胞术评估磷酸化stat3和shh的表达。(C类)用野生型（WT）或MFG-E8缺陷小鼠（MFG-E8KO）的TAM上清液刺激的CSC中stat3（SOCS3、MCL和VEGFA）和shh（GLi1、PRCH1和GAS1）的靶基因表达。(D类)MC38-CSC被Stat3、Sonic Hedgehog（shh）或两者的特异性siRNA感染，并在存在抗MFG-E8或等型匹配对照IgG的情况下，用WT或MFG-E8-缺陷TAM上清液（1:10稀释）处理24小时。细胞活力通过比色分析裂解caspase-3强度进行量化*P（P）<与加扰siRNA相比为0.05(E类)用野生型（WT→MFG-E8 KO）或MFG-E8KO（MFG-E8-KO→MFH-E8KO）骨髓重建嵌合小鼠为MFG-E8/缺陷宿主(n个=每组4人）。移植后8周，将MC38-CSCs皮下接种到每只嵌合体小鼠中，然后在肿瘤激发后的第10、12、14和16天用CDDP治疗小鼠，包括或不包括AG490、环胺或两者。在指定日期测量肿瘤生长。在两个独立的实验中获得了类似的结果，并显示了具有代表性的结果。
图5。
图5。
MFG-E8和IL-6协同触发人CSC的化疗耐药。(A类)用重组MFG-E8（50 ng/mL）、IL-6（10 ng/mL。(B类)原发性NSCLC-CSC用TAM或PBM上清液（1:10稀释）处理，超低附着板中存在抗-MFG-E8抗体和/或抗-IL-6抗体。然后将细胞培养三代，并测定每10000个细胞生成的球形物的数量。(C类)用CDDP和TAM或PBM上清液（1:10稀释）在存在或不存在抗MFG-E8 Ab或抗IL-6 mAb的情况下处理原发性NSCLC-CSC 24 h，并用比色法通过裂解caspase-3强度来量化细胞活力。(D类)将原代NSCLC-CSC接种到氯膦酸钠致NOD-SCID小鼠中(n个=每组4个）与CD68+从原发性肿瘤（TAM）中分离出的巨噬细胞，用同型IgG、抗MFG-E8抗体和/或抗IL-6单克隆抗体或两者处理，并在指定的日期测量肿瘤生长。不含TAM的NSCLC-CSC作为阴性对照（−）。比较单药治疗（抗MFG-E8或单独抗IL-6）和联合治疗方案之间的肿瘤生长差异。数据是三个独立实验的代表。
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