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.2011年7月11日；194(1):89-103.
doi:10.1083/jcb.201011118。

α-突触核蛋白和ALPS基序是膜曲率传感器，其对比化学介导选择性囊泡结合

Iwona M Pranke公司 1, 文森特·莫雷洛, 若埃尔·毕盖, 金伯利·吉布森, Jean-Marc Verbavatz女士, 布鲁诺·安东尼, 凯瑟琳·杰克逊
附属公司

α-突触核蛋白和ALPS基序是膜曲率传感器，其对比化学介导选择性囊泡结合

Iwona M Pranke公司等。 J细胞生物学. .

摘要

膜曲率传感器具有不同的结构和化学性质，这表明它们可能具有区分细胞中不同类型囊泡的内在能力。在本文中，我们比较了两种曲率传感器的体外和体内膜结合特性，这两种传感器形成了非常不同的两种两亲螺旋：高尔基囊泡系链的两亲脂质堆积传感器（ALPS）基序和帕金森病病原体突触囊泡蛋白α-突触核蛋白。我们证明了α-突触核蛋白感知膜曲率的机制。与ALPS基序不同，α-突触核蛋白具有发育不良的疏水表面，这一特征解释了其对带负电荷的脂质和膜曲率的双重敏感性。当在酵母细胞中表达时，这两个曲率传感器针对不同类别的囊泡，即ALPS基序早期分泌途径的囊泡和α-突触核蛋白情况下带负电荷的内吞/高尔基后囊泡。通过互补化学结构，α-突触核蛋白和ALPS基序通过与不同脂质环境的直接相互作用，靶向细胞中不同的小泡。

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数字

图1。
图1。
GMAP公司N个和α-突触核蛋白导致酵母细胞中不同囊泡结构的积累。（A，顶部）GMAP示意图N个-m樱桃（mCh）。（底部）这种结构在酵母细胞中的定位。（B） 表达GMAP细胞的典型透射电镜图像N个-GFP。（C，顶部）α-synuclein–GFP示意图。（底部）酵母细胞定位。（D） 表达α-突触核蛋白–GFP的细胞的典型EM图像。（E） 表达GMAP的细胞的免疫金标记N个-使用抗GFP抗体的GFP。箭头显示泡状结构。N、 细胞核；V、 液泡；内质网；CW，细胞壁。（F） 菌株IPY4 GMAPN个-GFP和IPY5α-突触核蛋白（α-syn）-GFP在抑制条件下生长过夜，然后在指定的时间内转移（开放符号）或不转移（封闭符号）到诱导培养基，以及培养物在OD时的吸光度（Abs）600被监控。（G） GMAP本地化N个-mCherry和α-synuclein–GFP在野生型酵母细胞中同时表达。（顶部和底部）为单个单元获得的z堆栈的两个光学部分。在诱导条件下，将携带质粒上所示蛋白的BY4742细胞培养过夜（A–E）或4小时（G）并成像。
图2。
图2。
GMAP公司N个α-synuclein是中性脂质膜曲率的传感器，但不是。（A和B）GMAP-210（aa 1–38）和α-突触核蛋白AH的ALPS基序的结构特征以及脂质体结合实验的原理。（A） 假设GMAP-210的ALPS基序形成完美的α螺旋。α-突触核蛋白的结构来自最近的电子顺磁共振实验（Jao等人，2008）。（B） 为了清楚起见，只显示了两个11 mer重复序列（aa 9–30），但AH的其余部分显示了相同的特征。黄色：Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe和Trp。粉红色：Ser、Thr和Gly。红色：天冬氨酸和谷氨酸。蓝色：赖氨酸和精氨酸。绿色：其他残留物。为了监测脂质结合，在AH开始时用半胱氨酸上的NBD标记构建物（GMAP中M1C突变N个α-突触核蛋白中的V3C）。该图近似于半径（R）＝30nm的脂质体的比例。[NBD]GMAP的（C和D）发射荧光光谱N个（C） 或[NBD]α-突触核蛋白（D；每种125 nM），含或不含校准的中性脂质体，通过规定孔径的聚碳酸酯过滤器或超声波挤压获得（150µM磷脂；鸡蛋PC/POPE=7:3；胆固醇/磷脂=1:5）。（顶部插图）530 nm处的荧光水平是脂质体半径的函数（由动态光散射测定）。水平线表示不含脂质体时的荧光水平。（C，底部插图）125 nm的530 nm荧光[NBD]GMAPN个作为磷脂浓度的函数。超声和挤压脂质体的颜色编码如左图所示。分配系数的计算如前所述（参见材料和方法；Mesmin等人，2007）。N、 N末端；C、 C终点。
图3。
图3。
α-突触核蛋白感知带负电的脂质膜弯曲的能力取决于其发育不良的疏水面。（A） 野生型α-突触核蛋白与含有越来越多POPS（0–80 mol%）的小脂质体的结合，以POPC（80–0 mol%。剩余的磷脂为鸡蛋PC（20 mol%），胆固醇/磷脂比为1:2。脂质体通过30纳米聚碳酸酯过滤器挤压获得。该图报告了530 nm处的荧光，这是根据左图所示的光谱以及使用相同成分的超声脂质体进行的实验测得的。挤压脂质体和超声脂质体的半径分别为46-53和23-48 nm。（B） 野生型α-突触核蛋白与大小校准带电脂质体的结合（鸡蛋PC/POPS=4:6；胆固醇/磷脂=1:2）。右图中使用的三个符号对应三个独立的实验。（插图）125 nM[NBD]α-突触核蛋白的荧光（fluo）作为磷脂浓度的函数。超声和挤压脂质体的颜色编码如左图所示。材料和方法中描述了分配系数的计算。（C） α-突触核蛋白AH区的序列突出了该区的重复特征，可分为11个重复序列。T6突变体携带的突变包括用更疏水的残基（Leu或Phe，黄色；右侧）替换非极性区域的所有苏氨酸残基（粉红色；左侧）。突变残基在11-mer重复序列中的位置是方框（野生型；左侧）或阴影（突变型；右侧）。颜色编码如图2所示；在排列中，只有突变的和带电荷的残基被着色。（D） T6突变α-突触核蛋白与含有越来越多POPS的小脂质体的结合，以POPC为代价，如A.（E）T6突变的α-突触核蛋白与大小校准的带电脂质体的连接，如B.蛋白质在A、B、D和E中的浓度为125 nM，磷脂为150µM。将A和D中的数据拟合（虚线）到S形函数（y=A+bxn个/（c+xn个)). B和E中的虚线仅用于说明作为脂质体半径函数的结合曲线的外观形状。
图4。
图4。
GMAP公司N个α-突触核蛋白结构与酵母中不同的区室标记物共定位。（A） GMAP在SEY6210细胞中的定位N个-mCherry与GFP-Emp47p或亲α因子-柠檬酸以及Anp1p单体RFP（mRFP）与GMAPN个-GFP。（顶部）GMAP共定位的代表性图像N个-mCherry和GFP-Emp47p。（底部）对于量化，在30和100 GMAP之间N个根据货物蛋白的存在与否对结构进行评分，并计算百分比（见材料与方法）。（B） GMAP在SEY6210细胞中的定位N个-mCherry与所指示的GFP标记的蛋白质。按照GMAP中BY4742的A.（C）定位进行量化N个-GFP或α-synuclein–GFP（α-syn）与FM4-64。GMAP BY4742中的（D–F）本地化N个-mCherry或α-突触核蛋白–mCherry，带有携带指定数量赖氨酸残基的GFP标记的电荷探针。显示了量化（D）和代表性图像（E和F）。在诱导条件下，在23°C（A–C）或16°C（D–F）下培养细胞过夜，然后对活细胞进行成像和定量。显示了至少三个独立实验的平均值和标准偏差。单元格的轮廓用虚线表示。棒材，2µm。
图5。
图5。
GMAP-210的ALPS基序是细胞质泡状结构的定位决定因子。（A） GMAP截断版本的本地化N个-mCherry删除了ALPS图案（示意图，左侧）。显示荧光（左）和叠加在微分干涉对比图像（右）上。（B，左）构件的本地化（底部）如示意图（顶部）所示。ALPS–Smc1-CC通过替换GMAP的CC区域构建N个核蛋白Smc1p（aa 158–374）。（右）定量时，对每个GFP融合蛋白的60–130个结构进行评分，以定位到核（如Hoechst染色所示）或细胞质。显示的结果代表了两个独立的实验。单元格的轮廓用虚线表示。（C） 表达ALPS–Smc1-CC–GFP嵌合蛋白的细胞的典型EM图像。插图显示了方框区域的放大倍数较高。表达所示蛋白的BY4742细胞在成像前在诱导条件下培养过夜。
图6。
图6。
α-突触核蛋白的前38个氨基酸作为包含胞内标记物的外周囊泡结构的定位决定因子。（A） GMAP示意图N个-GFP和α-突触核蛋白嵌合体-GFP探针及其在酵母细胞中的定位。（B） α-synuclein嵌合体-GFP（α-syn-chim）与FM4-64（顶部）和Rtn1p-mRFP（底部）的定位，以及α-synnuclein嵌合体-mCherry与Lucifer黄的定位（LY；中部）。（A和B）棒材，2µm。（C） B.（D）菌株IPY6α-突触核蛋白嵌合物-GFP在抑制条件下生长过夜，然后在指定的时间内将（开放符号）或不将（封闭符号）转移到诱导培养基中，以及培养物在OD时的吸光度（Abs）600被监控。（E） 表达所示结构的BY4742细胞在诱导条件下培养过夜，并用FM4-64处理，按照材料和方法中的描述测定空泡结构中的荧光信号水平。（F和G）BY4742细胞表达α-突触核蛋白嵌合物–GFP诱导16小时的典型EM图像。箭头显示囊泡结构。N、 细胞核；五、 液泡；CW，细胞壁。显示了至少三个独立实验的平均值和标准偏差。
图7。
图7。
α-突触核蛋白嵌合探针与内吞和高尔基体后标记物特异性共定位。（A–C）用所示的mCherry-tagged标记定位α-synuclein嵌合体-GFP（α-syn-chim）。显示了mCherry-Bos1p（A）和mCherry-Snc1p（B）的代表性图像。定量如C所示。细胞在抑制条件下生长过夜，然后转移到诱导培养基中2.5（A–C）或4小时（C）。显示了至少三个独立实验的平均值和标准偏差。棒材，2µm。
图8。
图8。
反转ALPS基序不会影响GMAP的容量N个积累早期分泌途径小泡。（A） GMAP-210 ALPS基序及其反转序列（顶部）及其螺旋轮表示（底部）。黄色：Val、Leu、Ile、Met、Phe和Trp。粉红色：Ser和Thr。红色：天冬氨酸和谷氨酸。蓝色：赖氨酸和精氨酸。灰色：其他残留物。（B） 表达invALPS-GMAP的细胞的典型EM图像。插图以更高的放大倍数显示方框区域。N、 细胞核；五、 液泡；CW，细胞壁。（C） 诱导4小时后invALPS-GMAP–mCherry与GFP-Bet1p定位（顶部），诱导2.5小时后inv ALPS-GMAP–GFP与FM4-64定位（底部）。棒材，2µm。（D） 在诱导后的指定时间，用GFP-Bet1p、GFP-Sec22p或GFP-Emp47p量化invALPS-GMAP–mCherry的定位，或用FM4-64定量invALPS–GFP的定位。将携带质粒上指示蛋白的SEY6210（或用于FM4-64成像的BY4742）细胞在诱导条件（B）下培养过夜，或在抑制条件下培养过晚，然后转移到诱导培养基中培养2.5或4小时（C和D）。显示了至少三个独立实验的平均值和SD。单元格的轮廓用虚线表示。N、 N终点；C、 C终点。
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参考文献

    1. Antony B.2011年。膜曲率传感机制。每年。生物化学评论。80:101–123 10.1146/年度-生物化学-052809-155121-内政部-公共医学
    1. Auluck P.K.，Caraveo G.，Lindquist S.，2010年。α-突触核蛋白：帕金森病的膜相互作用和毒性。每年。Rev.细胞发育生物学。26:211–233 10.1146/annurev.cellbio.042308.113313-内政部-公共医学
    1. Bankaitis V.A.、Mousley C.J.、Schaaf G.，2010年。Sec14超家族与脂质代谢和脂质信号传导之间的串扰机制。生物化学趋势。科学。35:150–160 10.1016/j.tibs.2009.10.008-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. BellíG.、GaríE.、Piedrafita L.、Aldea M.、Herrero E.1998年。激活物/阻遏物双重系统允许四环素在芽殖酵母中紧密调节基因表达。核酸研究26:942–947 10.1093/nar/26.4942-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ben Gedalya T.、Loeb V.、Israel E.、Altschuler Y.、Selkoe D.J.、Sharon R.，2009年。α-同核蛋白和多不饱和脂肪酸促进氯氰菊酯介导的内吞作用和突触囊泡再循环。交通。10:218–234 10.1111/j.1600-0854.2008.00853.x-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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