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.2011年8月5日；43（3）：449-63。
doi:10.1016/j.molcel.2011.06.011。 Epub 2011年7月7日。

cIAPs阻断Ripoptosome形成，一种RIP1/caspase-8，包含由cFLIP亚型差异调节的细胞内死亡复合物

玛丽亚·费克蒂斯托娃 1, 彼得·盖塞里克, 比特·凯勒特, 戴安娜·帕纳约托瓦·迪米特洛娃, 克劳迪娅·朗莱斯, 迈克·胡普, 凯文·凯恩, 玛丽恩·麦克法兰, 格奥尔格·海克尔, 马丁·勒沃库斯
附属公司

cIAPs阻断Ripoptosome形成，一种RIP1/caspase-8，包含由cFLIP亚型差异调节的细胞内死亡复合物

玛丽亚·费奥克蒂斯托娃等。 分子电池. .

摘要

cIAP对细胞死亡途径的细胞内调节一直是个谜。在这里，我们发现cIAP的丢失促进了细胞内平台的自发形成，激活了凋亡或坏死。这种2 MDa细胞内复合物，我们称之为“Rippotosome”，对细胞死亡是必要的，但还不够。它包含RIP1、FADD、caspase-8、caspase-10和caspase抑制剂cFLIP亚型。cFLIP（L）阻止Ripoptosome的形成，而有趣的是，cFLIP促进Ripoptocome的组装。当cIAP缺失时，caspase活性是由Ripoptosome中cFLIP亚型控制的“变阻器”，并决定细胞死亡是由RIP3依赖性坏死还是caspase依赖性凋亡引起的。RIP1是复合体的核心组件。正如我们对TLR3激活的研究所证明的那样，我们的数据表明，Ripoptosome严重影响膜结合受体触发的结果。Ripoptome介导的细胞死亡的不同质量可能在炎症反应期间引起重要的病理生理学后果。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
IAPs保护细胞免受TLR3诱导的细胞凋亡和坏死（A、B、F和H）通过结晶紫测定分析细胞活力；显示了三个独立实验（±SEM）的平均值。（A） 用IAP拮抗剂预处理HaCaT、A5RT3和MET-1细胞，然后用50μg/ml poly（I:C）刺激。插图显示了通过蛋白质的western blotting对细胞裂解产物的分析。（B–D和H）细胞按照实验程序进行刺激。（B） 在缺乏cIAP的情况下，TLR3连接以caspase和RIP1激酶依赖的方式诱导细胞死亡。（C） cIAP抑制TLR3刺激后HMGB1的释放。通过对无细胞上清液和总细胞裂解液进行western blot分析，检测HaCaT中HMGB1的释放。（D） cIAP保护细胞免受TLR3连接诱导的凋亡和坏死。通过同时用Hoechst-33342和SYTOX-Green染色，然后分别用透射和荧光显微镜观察HaCaT细胞的细胞死亡形态（补充实验程序）。（E） 在转染对照或TNFR1 siRNA的HaCaT细胞中，通过western blot分析来分析TNFR1的敲除。（F）TNFR1敲除不会改变TLR3诱导的细胞死亡。（G） TLR3诱导的caspase-8复合物与TNF复合物II的比较。为了分析含有caspase-8的复合物，进行了caspase-8-共免疫沉淀（IP）。用IAP拮抗剂预刺激细胞，然后用poly（I:C）或TNF（10μg/ml）刺激细胞。（H） 在缺乏IAP功能的情况下，初级人类角质形成细胞（来自五个不同的供体[不同的符号；横条表示所有五个受检供体的平均值]）对TLR3诱导的细胞死亡敏感。IAP拮抗剂（面板3-4）或TWEAK（面板5-6）以TNF-非依赖性方式对TLR3诱导的细胞死亡敏感（面板7-12）。
图2
图2
cIAP缺失导致的细胞死亡增加是在裂体处调节的；RIP1是关键的，而RIP3或Caspase-8调节细胞死亡质量（A）Caspase-8siRNA的功能由Caspase-8蛋白的western blot分析确定。（B） 用qPCR分析HaCaT中RIP3敲除的效率。显示了两个独立实验（±SEM）的平均值。（C和D）细胞按照实验程序进行刺激。结晶紫法检测细胞活力；显示了三个独立实验的平均值（±SEM）。（C） 在没有cIAP的情况下，TLR3诱导的细胞死亡质量取决于caspase-8或/和RIP3的表达。（D） 在缺乏cIAP的情况下，敲除RIP1可保护HaCaT免受TLR3诱导的细胞死亡。通过western blot分析（插图）分析RIP1的敲除效率。（E） RIP1敲低抑制Rippotosome的形成。Caspase-8免疫沉淀（IP）按照实验程序进行。长时间接触印迹显示caspase-8/RIP1在非刺激条件下的关联，或者代表生化实验的背景。
图3
图3
cFLIP在缺乏cIAP的情况下抑制裂体形成和凋亡（A）cFLIP保护TLR3诱导的细胞死亡。用对照shRNA（HRS）或cFLIP shRNA转导A5RT3细胞，并按照实验程序进行刺激。结晶紫法检测细胞活力；显示了三个独立实验（±SEM）的平均值。（B） cFLIP抑制A5RT3细胞中Rippotosome的形成。用半胱天冬酶-8 IP研究裂体的形成。请注意cFLIP击倒后caspase-10的戏剧性积累。
图4
图4
cFLIP异构体在没有cIAP的情况下不同地调节裂体形成和调节细胞死亡质量（A）细胞死亡质量受cFLIP亚型的不同调节。用cFLIP转导HaCaT细胞L（左）、cFLIPS公司或单独使用载体，并按照实验程序进行刺激。细胞死亡采用Annexin V/PI双重染色，随后进行FACS分析。（B） 纹状体的形成受到cFLIP亚型的不同调控。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8抗体使裂体沉淀。（C） 与HaCaT-cFLIPs相比，IAP拮抗剂治疗后PK中未自发形成Rippotosome。
图5
图5
cFLIP公司S公司在不存在cIAP的情况下促进自发裂体形成，一种2 MDa复合物；RIP1激酶和RIP3依赖性方式独立于TNF信号转导（a、B和E）cFLIP的Ripoptosome-Induced Necroptosis进展S公司-用对照或TNFR1 siRNA转染HaCaT。（A、C和D）用结晶紫法分析细胞活力；显示了三个独立实验（±SEM）的平均值。（A） cIAP缺失诱导cFLIP细胞自发性死亡S公司细胞独立于TNFR1。用IAP拮抗剂预刺激siRNA-转染细胞，然后用TNF（100 ng/ml）刺激。（B） HaCaT-cFLIP的自发性细胞死亡S公司IAP拮抗剂独立于自分泌TNF信号。分别用IAP拮抗剂和TNFR2-Fc刺激细胞。细胞死亡通过Annexin V/PI双重染色和FACS分析确定。（C） HaCaT-cFLIP中cIAPs缺失诱导的自发性细胞死亡S公司依赖RIP1激酶。（D） HaCaT-cFLIP中cIAP缺失诱导的细胞自发性死亡S公司依赖于RIP3。HaCaT-cFLIP公司S公司用RIP3 siRNA或对照siRNA转染，然后用IAP拮抗剂处理。（E） HaCaT-cFLIP中自发的裂体形成S公司在没有cIAP的情况下，独立于TNFR1信号。在zVAD存在下，通过caspase-8 IP分析2×10的裂体形成6在IAP拮抗剂刺激（200nM）后4小时转染的细胞。（F） 抑制cIAP可促进2 MDa复合体Ripoptosome的形成。HaCaT-cFLIP公司S公司单独用zVAD（10μM）或与IAP拮抗剂（200 nM）联合预刺激4小时。细胞裂解物用于色谱凝胶过滤分析。数字表示收集的分数。通过western blotting（左面板）分析组分3–26的各个蛋白质。随后按照指示将所有组分合并，并按照实验程序中的描述执行caspase-8 IP。通过western blotting分析在不同混合组分中发现的蛋白质。
图6
图6
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性受cFLIP等位基因的不同调节，并受蛋白酶体功能（A和C）的负调控。（A） cFLIP亚型对Ripoptosome中caspase活性的调节存在差异。HaCaT-cFLIP公司S公司用IAP拮抗剂和zVAD刺激细胞1小时，单独用poly（I:C）或稀释剂。（B） 在没有cIAP的情况下，cFLIPS公司但不是cFLIPL（左）阻断Rippotosome中caspase-8的活性。用含有标记cFLIP的逆转录病毒载体转导HaCaT细胞L（左）或cFLIPS公司用IAP拮抗剂单独或随后用poly（I:C）预刺激细胞，然后用抗Flag IP。星号表示Abs的非特异性结合。（C） HaCaT-cFLIP中的蛋白酶体功能负调控裂体形成S公司用MG132预刺激细胞10分钟，然后用IAP拮抗剂刺激细胞4小时。（A）–（C）中所示的实验是在zVAD（10μM）存在下进行的。
图7
图7
视紫红质激活和信号传导的工作模型及其cFLIP异构体的调节RIP1的一部分不断“修饰”（可能是通过细胞应激信号）为活性构象。cIAP泛素化“修饰”RIP1，靶向26S蛋白酶体降解。未知的细胞隔室不仅包含“修饰的”RIP1，还包含caspase-8、FADD和cFLIP。IAP拮抗剂的添加导致cIAP的自泛素化和降解。这是Ripoptosome形成的信号，它是一种由“修饰的”RIP1、FADD、caspase-8/10和cFLIP亚型组成的复合物。Ripoptosome可以被招募到RHIM绑定模块，如TRIF，从而将其与TLR3连接。根据Rippotosome的成分，它激活凋亡和/或坏死性下垂。Rippotosome中的Procaspase-8同源二聚体形成活性caspase-8和随后的凋亡。cFLIP公司L（左）-Rippotosome内的胱天蛋白酶-8异二聚体在复合物中具有酶活性，不足以产生诱导细胞凋亡所必需的活性胱天蛋白酶-8异四聚体，尽管足以切割RIP1。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8-cFLIPS公司异二聚体缺乏蛋白水解酶活性，这不仅是caspase-8完全激活所必需的，也是RIP1降解所必需的。因此，RIP1在Rippotosome中积累，并以RIP1激酶依赖的方式通过RIP3启动坏死性下垂。
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中的注释

  • 裂体：细胞溶质中的死亡决定。
    Bertrand MJ、Vandenabeele P。 Bertrand MJ等人。 分子细胞。2011年8月5日；43(3):323-5. doi:10.1016/j.molcel.2011.07.007。 分子细胞。2011 PMID：21816342
  • 一个新的死亡平台。
    Wrighton KH公司。 Wrighton KH公司。 Nat Rev Mol细胞生物学。2011年8月18日；12(9):547. doi:10.1038/nrm3174。 Nat Rev Mol细胞生物学。2011 PMID：21850033 没有可用的摘要。

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    1. Bertrand M.J.、Milutinovic S.、Dickson K.M.、Ho W.C.、Boudreault A.、Durkin J.、Gillard J.W.、Jaquith J.B.、Morris S.J.、Barker P.A.cIAP1和cIAP2作为E3连接酶促进RIP1泛素化，从而促进癌细胞存活。分子细胞。2008;30:689–700.-公共医学
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