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.2011年8月；152(8):3143-54.
doi:10.1210/en.2011-0155。 Epub 2011年6月14日。

血管平滑肌细胞AKT活化介导IGF-I通过S485磷酸化抑制高血糖期间AMPK活化

君余宁 1, 冈西, 大卫·R·克莱蒙斯
附属公司

血管平滑肌细胞AKT活化介导IGF-I通过S485磷酸化抑制高血糖期间AMPK活化

君余宁等。 内分泌学. 2011年8月.

摘要

作为代谢传感器，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AMP-activated protein kinase（AMPK）促进细胞适应营养素、激素和生长因子产生的信号。IGF-I刺激蛋白质合成的能力被AMPK抑制，因此，这些研究旨在确定IGF-I是否调节AMPK活性。IGF-I剂量依赖性地抑制AMPK T172的磷酸化，并刺激血管平滑肌细胞（VSMC）中AMPK S485的磷酸化。为了确定AMPK S485磷酸化的刺激是否介导了这种反应，用突变的AMPKα（AMPK S485A）转导VSMC。这种改变形式的表达抑制了IGF-I抑制AMPK T172激活的能力，这导致IGF-I刺激的P70S6激酶磷酸化受到抑制。相反，AMPK S485D突变体的表达导致AMPK活性的构成性抑制，并与IGF-I刺激的P70S6K磷酸化和蛋白质合成增加相关。添加特定AKT抑制剂或表达AKT1短发夹RNA抑制AMPK S485磷酸化，并减弱IGF-I诱导的AMPK T172磷酸化降低。暴露于高糖浓度下抑制AMPK活性并刺激S485磷酸化，IGF-I刺激S485磷酸化和AMPK T172抑制的进一步增加。我们得出结论，AMPK S485磷酸化通过调节T172对高糖和IGF-I的磷酸化反应负调控AMPK活性。IGF-I通过AKT1刺激S485磷酸化合。结果表明，AMPK在调节IGF-I刺激的蛋白质合成中起抑制作用，IGF-I必须下调AMPK活性才能诱导最佳合成代谢反应。

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数字

图1。
图1。
高糖损害VSMC中AMPK的激活。A和B，VSMC在DMEM-NG（5 m）中生长汇合米，NG）加上10%FBS，并在添加指定浓度的葡萄糖（A）或将葡萄糖浓度从5 m更改为20 m之前剥夺血清16 h米葡萄糖（NHG）并孵育所指示的时间（B）。甘露醇被用作渗透控制。用抗pAMPK（T172）和AMPK抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。C、 在DMEM-NG和10%FBS中培养VSMC，并在添加指示浓度的葡萄糖之前剥夺血清16h。24小时后，二甲双胍（3 m米)按照指示再添加18 h。用抗pAMPK（T172）或AMPK抗体对细胞裂解物进行免疫印迹（IB）。这些数字代表了三个独立的实验。
图2。
图2。
高糖和IGF-I抑制AMPK活化，与AMPK S485磷酸化和AKT活化增加相关。VSMC在DMEM-NG（5 m米，NG）或DMEM-HG（25米米（HG）加10%FBS。在任何治疗之前，细胞都会被血清饥饿16小时。A、 添加IGF-I（10 ng/ml）10 min；B、 增加IGF-I浓度10min；C、 二甲双胍（Met，3米米)如图所示，在添加IGF-I（10 ng/ml）之前添加18 h。用抗pAKT（S473）、pAMPK（S485）或pAMPK（T172）抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。为了控制装载量，去除印迹并用抗AKT或AMPK抗体进行复制。条形图显示了AMPK蛋白磷酸化的相对差异，其中AMPK磷酸化蛋白的带强度除以总AMPK蛋白质带强度。误差线代表平均值±东南方. *,对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对<0.001（两个治疗组之间的显著差异）。这些数字代表了三个独立的实验。控制，控制。
图3。
图3。
AMPK S485的磷酸化介导AMPK活性对葡萄糖和IGF-I的抑制。AMPK WT-和S485A及S485D突变体过度表达细胞在DMEM-NG（5 m米，NG）或DMEM-HG（25米米，HG）。A、 细胞裂解物分别用抗HA和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹（IB）。B、 细胞裂解物用抗HA抗体免疫沉淀，用抗pAMPK（T172）免疫印迹。为了控制装载量，去除印迹并用抗AMPK抗体重制。C、 用二甲双胍（3 m）培养细胞米)在IGF-I治疗10分钟前18小时，按照B.D中的描述分析细胞裂解物，细胞裂解物分别用抗pACC和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。这些数字代表了三个独立的实验。
图4。
图4。
IGF-I下游信号传导和生物作用受AMPK S485磷酸化调节。在DMEM-NG（5 m米，NG）或DMEM-HG（25米米，HG）。在IGF-I（10 ng/ml）治疗前，细胞被血清饥饿16 h。A和B，细胞裂解物用抗pP70S6激酶（T389）和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹；C和D、IGF-I刺激的蛋白质合成和细胞增殖按照材料和方法在四种细胞类型中的每一种细胞中，与潜伏期结束时的基础非刺激状态相比，IGF-I刺激后的倍数分别增加。在蛋白质合成测定中，四种细胞类型的基础值从1730±154DPM到1989±139DPM不等。在细胞增殖试验中，四种细胞类型中，试验结束时的基础细胞数量从24792±1366个/孔变化到29750±1573个/孔。*，对< 0.05; **,对<0.01（细胞类型之间存在显著差异）。这些数字代表了三个独立的实验。
图5。
图5。
AMPK S485磷酸化对AMPK激活的抑制作用依赖于AKT。A、 VSMC在DMEM-HG（25 m）中培养米添加AKT抑制剂（AKTi，0.5μ米)或二甲双胍（1米米)再按指示添加IGF-I（10 ng/ml），孵育10 min。用抗pAMPK（T172）、pAMPK（S485）、pAKT（S473）或pAKT抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。为了控制装载量，分别用抗AMPK或AKT抗体剥离和重制印迹。B、 表达靶向LacZ（LacZ-Si）的寡核苷酸或靶向AKT的三种不同寡核苷酸（AKT-Si-1、-2和-3）的细胞在DMEM-HG加10%FBS中生长汇合。细胞裂解物用抗AKT和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。C和D，表达LacZ Si和AKT Si（寡核苷酸2）的细胞生长到汇合处，然后剥夺血清16 h。如图所示，添加IGF-I（10 ng/ml）10 min。二甲双胍（3米米)在加入IGF-I之前加入18小时（D）。用抗pAMPK（S485）、pAMPK（T172）或AMPK抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。E–G，在DMEM-NG（NG）中生长过表达LacZ和组成活性AKT1（Ca-AKT1）的细胞。如图所示，添加IGF-I（10 ng/ml）10分钟。二甲双胍（3米米)在添加IGF-I之前添加18小时（G）。细胞裂解物分别用抗HA、pAMPK（S485）、pAMCK（T172）或总AMPK抗体进行免疫印迹。这些数字代表了三个独立的实验。
图6。
图6。
IGF-I和高血糖抑制糖尿病小鼠主动脉中AMPK的激活。糖尿病小鼠的制备方法如材料和方法在将小鼠处死之前，将IGF-I[1 mg/kg体重（BW），在PBS中稀释]或单独PBS（对照组）ip注射给小鼠。15分钟后，他们被安乐死。主动脉提取物按照材料和方法用抗pAKT（S473）或pAMPK（S485和T172）抗体对主动脉提取物进行免疫印迹。为了控制装载量，分别剥离印迹并用抗AKT和AMPK进行重制。B、 主动脉提取物用抗pACC（S79）、pmTOR（S2448）或pP70S6激酶（T389）进行免疫印迹。为了控制装载量，剥离印迹并用抗mTOR或β-肌动蛋白抗体进行复制。这些数字代表了三个独立的实验。
图7。
图7。
AKT-依赖性IGF-I在高血糖期间抑制AMPK激活是IGF-I信号转导和生物作用所必需的。IGF-I刺激的AKT活化诱导AMPK S485磷酸化，从而抑制AMPK活化标记物AMPK T172磷酸化。激活的AMPK抑制IGF-I下游信号传导和生物作用。在高血糖期间，IGF-I刺激的AKT激活增强，导致AMPK S485磷酸化增加和AMPK激活抑制，从而导致IGF-I信号转导的更大刺激。此外，高糖本身也能够抑制二甲双胍（Met）诱导的AMPK T172磷酸化。
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