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.2011年9月；301（3）：H841-7。
doi:10.1152/ajpheart.01247.2010。 Epub 2011年6月10日。

SPARC调节胶原与心脏成纤维细胞表面的相互作用

布雷特·哈里斯 1, 张玉华, 劳伦·卡德, 李·B·里维拉, 罗尔夫·布雷肯, 艾米·D·布拉德肖
附属公司

SPARC调节胶原与心脏成纤维细胞表面的相互作用

布雷特·哈里斯等。 美国生理学杂志心脏循环生理学. 2011年9月.

摘要

与野生型（WT）小鼠相比，不表达酸性分泌蛋白和富含半胱氨酸（SPARC）的小鼠的心脏组织在基线水平和压力超负荷肥大反应中减少了不溶性胶原蛋白含量。然而，SPARC影响心肌胶原的细胞机制尚不明确。虽然体外检测到心肌细胞表达SPARC，但心脏免疫组织化学显示SPARC染色主要与间质成纤维细胞相关。通过[（3）H]脯氨酸掺入前胶原和前胶原加工的免疫印迹分析，检测从SPARC-null和WT小鼠分离的原代心脏成纤维细胞的I型胶原合成。细菌胶原酶用于区分细胞内和细胞外形式的I型胶原蛋白。与WT细胞相比，SPARC-null细胞的I型胶原数量增加，且在不含前肽的SPARC-null成纤维细胞上检测到的I型总胶原蛋白的比例高于WT细胞。此外，SPARC阴性细胞对胶原酶消化（胞外）敏感的总胶原蛋白量大于WT细胞，表明在缺乏SPARC的情况下，细胞表面相关胶原蛋白增加。此外，在SPARC阴性的成纤维细胞中发现了较高水平的V型胶原，这是一种与胶原原纤维起始有关的原纤维胶原。SPARC的缺失并未导致心脏成纤维细胞增殖或I型前胶原生成的显著差异。我们得出结论，SPARC通过调节前胶原的加工以及与成纤维细胞表面的相互作用来调节心脏中的胶原蛋白。这些结果与SPARC阴性小鼠心脏间质胶原蛋白水平降低一致，这主要是由于胶原蛋白沉积到细胞外基质中的效率低下，而不是胶原蛋白生成的差异。

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数字

图1。
图1。
小鼠心脏中酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白（SPARC）免疫反应的免疫荧光。A类：SPARC染色主要在野生型（WT）小鼠与成纤维细胞相关的心脏间质中检测到[放大区域内箭头所示的红色染色(插入)].B类：从SPARC阴性心肌生成的切片显示无可检测的SPARC免疫反应。C–I类：WT段。C类：凝集素染色（绿色）表示内皮细胞，标记了大量心肌细胞（CM）周围的间质，但未与SPARC免疫反应细胞共定位（红色箭头，绿色箭头：凝集酶阳性细胞）。D–G型：用α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA；绿色染色）标记冠状血管平滑肌细胞，发现该细胞群不表达SPARC；然而，可以发现表达SPARC的间质细胞与这些假定的血管并列（F类和G公司).H（H）：SPARC阳性成纤维细胞定位于富含I型胶原蛋白表达的心脏间质区域（绿色染色）。我：高放大图像显示I型胶原标记的间质内有SPARC阳性的成纤维细胞（红色箭头）（绿色箭头）。4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（dapi）复染（蓝色）显示细胞核C–H型棒材=20μm。
图2。
图2。
在对1%FCS的反应中，SPARC-null与WT心脏成纤维细胞的增殖率没有发现显著差异。[三H] 胸腺嘧啶核苷掺入法检测细胞增殖。结果显示，三个单独的实验具有代表性，使用从四个SPARC阴性心脏或四个WT心脏分离的三个混合成纤维细胞孔。错误栏显示SE。中的差异[三H] Student’s未发现WT和SPARC阴性细胞之间的胸腺嘧啶掺入显著t吨-测试。抗坏血酸。
图3。
图3。
与WT肌成纤维细胞相比，SPARC阴性心肌成纤维细胞培养物显示细胞相关胶原I增加，但α-SMA阳性肌成纤维纤维细胞数量没有增加。WT的α-SMA染色(A类)和SPARC-空(B类)原代培养表明，不同基因型之间的肌成纤维细胞体外转化率没有显著差异（见正文）。然而，SPARC-null中细胞相关胶原I免疫反应性（箭头）增加(D类)与WT相比(C类)成纤维细胞。
图4。
图4。
SPARC阴性成纤维细胞增加了细胞外细胞相关胶原I的数量。A类：使用胶原酶和不使用胶原酶处理的原代成纤维细胞洗涤剂-可溶性细胞提取物的免疫印迹分析。与WT细胞相比，SPARC无效细胞中更多的细胞相关胶原I对消化（即细胞外）敏感。B类和C类：用五个独立的原代细胞分离物进行的五个独立免疫印迹实验的定量。B类：SPARC阴性细胞中对胶原酶消化敏感的总胶原蛋白百分比持续升高。C类：细胞相关胶原-α水平1（一） [加工胶原蛋白-α1（一） 在没有SPARC表达的情况下，去除这两个前肽后]也持续增加。错误栏显示SE*P（P）<0.05 vs.WT.β-组分，代表I型胶原的两个（三个）共价连接α-亚基的条带；pC，前胶原-α1（一） 与NH2-去除前肽；pN，前胶原-α1（一） 去除COOH-前肽。
图5。
图5。
A类：在无SPARC的心脏成纤维细胞培养物中以浓度依赖的方式添加重组（r）SPARC，可降低洗涤剂可溶性胶原蛋白I的水平。B类：用五个独立的原始SPARC阴性细胞分离物进行的单独实验的免疫印迹分析定量。错误栏显示SE*P（P）与对照组相比<0.05。
图6。
图6。
SPARC阴性成纤维细胞产生的前胶原与WT细胞无显著差异。A类：荧光照相[三H] 脯氨酸标记的前胶原、前胶原中间体和胶原蛋白-α1（一） 在SPARC-null和WT成纤维细胞的洗涤剂可溶性细胞层中检测到。B类：来自四个分离的成纤维细胞分离物的放射性标记的胶原带的定量。错误栏显示SE。
图7。
图7。
SPARC阴性成纤维细胞表面的细胞外细胞相关V型胶原增加。A类：对含有V型胶原抗体的洗涤剂可溶性SPARC无效层和WT成纤维细胞层的代表性免疫印迹分析显示，在没有SPARC的情况下，细胞外V型胶原水平增加（显示了一个印迹的非相邻条带）。B类：用五个独立的原代细胞分离物进行的单独实验的免疫印迹分析定量。错误栏显示SE*P（P）=0.03 vs.重量。
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