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.2011年6月9日；2（6）：e170。
doi:10.1038/cddis.2011.52。

大麻二酚通过内质网应激诱导的细胞凋亡机制导致活化的肝星状细胞死亡

M P Lim公司 1, L A Devi公司, R罗森菲尔德
附属公司

Cannabidiol通过内质网应激诱导凋亡机制导致活化的肝星状细胞死亡

M P Lim公司等。 细胞死亡病. .

摘要

肝纤维化发展过程中的主要细胞事件是肝星状细胞（HSC）的激活。活化的HSC增殖并产生多余的胶原蛋白，导致瘢痕基质和肝纤维化的积聚。因此，诱导活化HSC死亡被认为是解决肝纤维化的一种手段。在这里，我们证明大麻二酚（CBD）是植物大麻的一种主要非精神活性成分，通过大麻素受体依赖机制诱导激活的HSC凋亡。CBD引发内质网（ER）应激反应，其特征是内质网形态的改变和RNA-依赖性蛋白激酶样ER激酶-、激活转录因子-6-和肌醇需要ER-核信号激酶-1（IRE1）介导的信号级联的启动。此外，CBD诱导促凋亡IRE1/ASK1/c-Jun N-末端激酶通路的下游激活，导致HSC死亡。重要的是，我们表明CBD诱导的内质网应激介导的凋亡机制对活化的HSC是特异性的，正如它发生在活化的人和大鼠HSC细胞系中，以及主要发生在活体活化的小鼠HSC中，但不发生在静止的HSC或大鼠的原代肝细胞中。最后，我们提供证据表明，激活的HSC内质网应激的基础水平升高，在其对CBD促凋亡作用的易感性中起作用。我们认为，CBD通过选择性诱导活化的HSC死亡，是一种潜在的治疗肝纤维化的药物。

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数字

图1
图1
CBD诱导活化的HSC凋亡。(一)在血清饥饿和用指定浓度的大麻素配体处理8小时后，用酸性磷酸酶测定活化大鼠HSC的细胞活力。细胞存活率表示为载体处理细胞中酸性磷酸酶活性的百分比，表示为平均值±S。三份实验的E.M。AM630，立方英尺2R拮抗剂；JWH（JWH133）、CB2R激动剂；PF（PF514273），CB1R拮抗剂；AM251，CB1R拮抗剂；ACEA、CB1R激动剂；CP55940，CB1R/CB公司2R激动剂；AEA，内源性CB1R/CB公司2R激动剂；2-AG，内源性CB1R/CB公司2R激动剂。(b)在无血清培养基中培养12小时后，在载体（DMSO）或5μM种指定的大麻素配体。PARP裂解表示为裂解PARP超过总PARP。(c（c）)PARP解理检测如下：(b)在用CBD处理的活化大鼠HSC中达到指定的浓度和时间。Western blot代表了n个=三个实验。(d日)激活的大鼠HSC在无血清培养基中孵育，5μM CBD持续2、4和8小时，然后对FITC膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）进行染色。用流式细胞仪对细胞进行分类和分析。Annexin V和/或PI阴性或阳性的细胞百分比显示在每个面板的相应象限中
图2
图2
CBD诱导内质网扩张和内质网应激标记物的表达。(一)在无血清培养基中用5μM CBD，无论是否存在1μM AM251或1μM AM630型。细胞裂解物进行western blot分析，并探测裂解的PARP以检测细胞死亡。**P（P）<0.01与控制（学生的t吨-测试）。的代表n个=三个独立实验。(b)用5μM CBD存在或不存在1μM AM251或1μ使用材料和方法中所述的酸性磷酸酶测定法测定M AM630。(c（c）)车辆-或5μ经M CBD处理的活化大鼠HSC在处理4小时后通过20倍放大的光学显微镜观察。(d日)活化大鼠HSC中calnexin（绿色）的免疫荧光染色。活化的HSC在无血清培养基中用载体或5μM指定时间段的CBD。按照材料和方法中的描述固定细胞并进行免疫染色处理。细胞核用DAPI（蓝色）染色。通过共焦显微镜在63倍放大率下观察细胞。(e（电子）)活化的大鼠HSC在无血清培养基中孵育，5μM CBD放置4小时，然后固定并进行电子显微镜处理。细胞在放大12000倍的条件下成像。白色箭头表示ER(（f）)将活化的大鼠HSC在无血清培养基中孵育0–24小时，并显示CBD浓度。细胞裂解物进行western blot分析，并检测CHOP和calnexin。的代表n个=三个独立实验
图3
图3
CBD的促凋亡作用是激活的HSC特有的。(一)来自对照组或乙醇喂养大鼠的HSC(b)初级鼠标体内-激活的HSC(c（c）)LX-2细胞（来自肝硬化患者的人HSC细胞系），以及(d日)原代大鼠肝细胞在无血清培养基中孵育μM CBD 0–8 h。对细胞裂解液进行western blot分析，并检测PARP、calnexin和CHOP，以检测细胞死亡和ER应激。(e（电子）)测定酸性磷酸酶活性，以确定用指示浓度的CBD处理8小时后，对照大鼠、乙醇喂养大鼠和原代大鼠肝细胞中的HSC的细胞存活率。Inset，western blot分析α-对照组或乙醇喂养大鼠HSC中SMA的表达。蛋白质印迹和细胞存活测定是n个=三个独立实验
图4
图4
CBD诱导内质网应激反应。(一)内质网应激反应信号通路的示意图。在(b)通过(e（电子）)，激活的大鼠HSC在无血清培养基中孵育μM中央商务区，除非另有说明，在指定的时间段内处理(b和c（c）)蛋白印迹(d日)RT-PCR，或(e（电子）)内质网应激介质的qRT-PCR分析。(b)对全细胞裂解物进行western blot分析，并探测磷酸化-PERK、磷酸化-eIF2α、磷酸-IRE1和P58IPK公司检测内质网应激反应中PERK和IRE1介导的臂。(c（c）)对细胞裂解物和核提取物进行western blot分析并探测ATF4、裂解ATF6α和XBP1检测细胞核中是否存在内质网应激转录因子。(d日)从细胞中提取总RNA并逆转录以获得用于PCR的cDNA，该cDNA带有XBP1特异性引物。琼脂糖凝胶电泳检测拼接XBP1。(e（电子）)使用ATF4、ATF6、CHOP和XBP1的基因特异性引物进行实时RT-PCR，以检测指定时间点的相对mRNA水平。结果归一化为GAPDH、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和RNA聚合酶II，并表示为相对于对照±S的倍数变化。E.M.公司(n个=三个独立实验，一式三份）。*P（P）<0.05;**P（P）<0.01;***P（P）<0.001与控制（学生的t吨-测试）
图5
图5
CBD诱导的细胞死亡由IRE1/ASK1/JNK途径介导。通过western blot分析测定了磷酸化-ASK1、磷酸化JNK和JNK的表达水平(一)LX-2细胞(b)来自乙醇喂养大鼠的HSC，以及(c（c）)初级鼠标体内-活化的HSC，在无血清培养基中用5μM中央商务区0-8小时(d日)DN IRE1的表达α在JS1细胞（小鼠活化的HSC）中，使用小鼠和人IRE1特异性引物通过RT-PCR进行评估α。使用野生型JS1和LX-2细胞作为对照。凝胶纯化PCR产物测序以确认突变IRE1的存在α（K599A DN IRE1α). (e（电子）)表达DN IRE1的JS1细胞α在无血清培养基中用5μM CBD处理0–4小时。通过蛋白质印迹分析测定PARP和磷酸化JNK的表达，并以折叠载体±S表示。控制或DN IRE1的E.Mα-表达JS-1细胞，n个=三个独立实验。(（f）)表达DN IRE1的JS1细胞α被视为CBD(e（电子）)然后用XBP1特异性引物进行总RNA分离和RT-PCR。琼脂糖凝胶电泳检测拼接XBP1。(克)用CBD处理LX-2细胞(一)在10人在场或不在场的情况下μ使用M JNK抑制剂4 h。Western blot分析测定PARP和磷酸化c-Jun的表达。分离的PARP表示为折叠控制±S。E.M.用于n个=四个独立实验。(小时)在存在或不存在JNK抑制剂的情况下，用CBD处理LX-2细胞(克)用酸性磷酸酶测定法测定细胞活力，并用平均值±S表示。三份实验的E.M。***P（P）<0.001;**P（P）<0.01;*P（P）<0.05
图6
图6
抑制内质网应激反应可防止CBD诱导的细胞死亡。(一)用针对ATF4的siRNA转染JS1细胞。16小时后，用5μM CBD在无血清培养基中培养8h后，采用Western blot分析测定PARP、ATF4和CHOP的表达，以折叠对照±S表示。E.M.用于n个=四个独立实验。(b)LX-2细胞用5μM CBD在无血清培养基中放置8小时，有无10小时μ伊马替尼抑制内质网应激。通过western blot分析测定PARP、CHOP和磷酸化JNK的表达，并将其表示为折叠载体±S。E.M.用于n个=四个独立实验。(c（c）)酸性磷酸酶活性用于测量CBD和伊马替尼处理后LX-2细胞的活力，如(b). 细胞活力表示为对照酸性磷酸酶活性±S的平均百分比。三份实验的E.M。***P（P）<0.001;**P（P）<0.05
图7
图7
基底内质网应力决定了对CBD的敏感性。(一)LX-2细胞在0–4无血清培养基中培养μM CBD在有或无衣霉素（1μg/mL）诱导内质网应激。通过裂解PARP的western blot分析检测细胞死亡，表达为折叠载体±S。E.M.用于n个=三个独立实验。(b)从乙醇饲料或对照大鼠HSC的全细胞裂解液中提取总RNA，并将其反转录为cDNA。使用ATF4、ATF6和CHOP的基因特异性引物进行实时PCR，以确定相对的基础mRNA水平，归一化为GAPDH并表示为折叠对照。***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(c（c）)通过与指定浓度的衣霉素在5μM CBD在无血清培养基中培养6小时。通过PARP和CHOP表达的western blot分析检测细胞死亡和ER应激。分离的PARP表示为折叠控制±S。E.M.用于n个=三个独立实验。*P（P）<0.05;**P（P）<0.01
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